缺氧對惡性膠質(zhì)瘤細胞“干性”的影響及其機制的研究.pdf

1、星形細胞腫瘤是顱內(nèi)最為常見的原發(fā)性腫瘤之一，占所有顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤的60％以上。盡管采取了包括外科手術(shù)及放化療在內(nèi)的綜合性治療措施，星形細胞瘤的預(yù)后仍然很差，膠質(zhì)母細胞瘤的平均生存時間仍不足一年。越來越多的證據(jù)表明，癌癥是一種干細胞疾病。癌癥干細胞，或稱為干細胞樣腫瘤細胞，是腫瘤組織中的一小群具有無限自我更新能力、多向分化潛能的特殊細胞群體。癌癥干細胞具有重要的生物學及治療學意義，它們被認為是腫瘤發(fā)生、演進及復發(fā)的細胞源泉。惡性膠質(zhì)瘤是最

2、早被證實存在癌癥干細胞的實體腫瘤之一，我們課題組前期亦從腦膠質(zhì)瘤新鮮組織及已建立的膠質(zhì)瘤細胞系，如U87及U251細胞中分離得到膠質(zhì)瘤干細胞并在體外成功培養(yǎng)和鑒定。癌癥干細胞，如同其相對應(yīng)的成體干細胞一樣，也需要某種特定的微環(huán)境，即niche，以維持其自我更新能力，保持未分化狀態(tài)。
　　缺氧是包括惡性膠質(zhì)瘤在內(nèi)的實體腫瘤的基本特征之一。缺氧通過激活多種信號通路，促進細胞存活、增加瘤細胞運動能力、促進腫瘤新生血管化，從而在腫瘤惡性進

3、展中發(fā)揮重要作用。新近有證據(jù)表明，缺氧可能是構(gòu)成膠質(zhì)瘤干細胞微環(huán)境的關(guān)鍵組分之一。缺氧在體外可維持腫瘤干細胞自我更新能力，保持其處于未分化狀態(tài)，但到目前關(guān)于缺氧與腫瘤干細胞關(guān)系的研究均系體外研究，尚缺乏來自臨床腫瘤樣本的直接證據(jù)；此外，缺氧調(diào)節(jié)腫瘤干細胞“干性”的分子機制尚缺乏研究。
　　研究目的:
　　1.探討缺氧標記物CA IX在惡性膠質(zhì)瘤中的表達規(guī)律及表達模式，重點觀測CA IX表達與腫瘤干細胞標志物表達之間的關(guān)系；<

4、br>　　2.探討惡性膠質(zhì)瘤組織中CA IX表達的臨床病理學意義，評價其作為預(yù)后指標的應(yīng)用價值；
　　3.探討缺氧對惡性膠質(zhì)瘤細胞功能的影響，重點觀測缺氧對細胞形態(tài)、克隆形成、干細胞標志物表達及分化的作用，以證明缺氧可誘導已分化瘤細胞去分化，獲得干細胞特性；
　　4.探討缺氧對膠質(zhì)瘤干細胞自我更新、分化及干細胞標志物表達的影響，以證明缺氧可維持或增強膠質(zhì)瘤干細胞“干性”；
　　5.初步探討Notch信號在缺氧誘導的GS

5、Cs“干性”維持或增強中的作用。
　　研究內(nèi)容和方法:
　　1.缺氧標記物CA IX在惡性膠質(zhì)瘤中的表達研究：以人惡性膠質(zhì)瘤組織標本為研究材料，采用免疫激光捕獲顯微切割(i-LCM)、免疫組化及雙標免疫熒光、激光共聚焦顯微術(shù)、實時定量PCR等技術(shù)，觀測CA IX在惡性膠質(zhì)瘤中的表達模式，評價其臨床病理學意義及與患者預(yù)后的關(guān)系，并著重探討CA IX表達與GSCs標志物表達之間的關(guān)系。
　　2.缺氧對惡性膠質(zhì)瘤細胞“干性”

6、調(diào)節(jié)的體外研究：以U87、U251細胞系及3例原代培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細胞為研究材料，建立缺氧培養(yǎng)模型，采用透射電鏡觀測瘤細胞超微結(jié)構(gòu)變化；MTT法檢測缺氧對生長的影響；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和細胞周期；Transwell小室檢測細胞遷移；克隆形成實驗檢測瘤細胞克隆形成能力；流式細胞術(shù)檢測CD133表達；分別采用實時定量PCR和Western blot檢測干細胞標志物及分化標志物mRNA和蛋白表達。
　　3.缺氧調(diào)控膠質(zhì)瘤干細胞“干性”的體

7、外研究：運用條件培養(yǎng)基壓力篩選的方法從上述膠質(zhì)瘤細胞中分離培養(yǎng)干細胞樣克隆球，并進行干細胞標志物鑒定；采用干細胞克隆形成實驗和分化實驗分別觀測缺氧對GSCs自我更新及分化的影響；流式細胞術(shù)檢測CD133表達；免疫熒光檢測干細胞及分化標志物表達；Western blot檢測干細胞標志物蛋白表達；
　　4. Notch信號通路在缺氧誘導的GSCs“干性”調(diào)節(jié)中作用的初步研究：采用Western blot檢測缺氧對GSCs Notch信

8、號關(guān)鍵分子表達的影響；以Notch信號特異性抑制劑DAPT處理細胞，檢測其對Notch1的抑制作用，確定合適的濃度(5μg/ml)；采用干細胞克隆形成及分化實驗觀測DAPT對缺氧誘導的GSCs“干性”增強及分化抑制的拮抗作用。
　　研究結(jié)果:
　　1.缺氧標記物CA IX在惡性膠質(zhì)瘤中的表達及其臨床病理學意義：CA IX在惡性膠質(zhì)瘤中呈過度表達，多表達于高級別膠質(zhì)瘤壞死灶周邊及低級別膠質(zhì)瘤侵襲性邊沿的瘤細胞。CA IX表達與

9、腫瘤組織學分級及大小關(guān)系密切；CA IX(++)組患者的總體生存期及無疾病進展生存期均顯著低于CA IX(+)及CA IX(-)組患者(p＜0.001)；多因素分析顯示CA IX(++)(p＜0.001)為預(yù)后差的獨立預(yù)測指標。
　　2.缺氧標記物CA IX表達與干細胞、侵襲標志物表達之間的關(guān)系：雙標免疫熒光檢測顯示CA IX陽性區(qū)域表達CD133、Oct4、Sox2及CXCR4的瘤細胞數(shù)目均分別顯著高于臨近的CA IX陰性區(qū)域，

10、而CA IX的表達與p53及Ki-67無關(guān)；顯微切割獲得的CA IX陽性瘤細胞CA IX、Oct4、Sox2及CXCR4 mRNA水平明顯高于相對應(yīng)的臨近CA IX陰性瘤細胞。
　　3.缺氧對惡性膠質(zhì)瘤細胞“干性”調(diào)節(jié)的體外研究：缺氧培養(yǎng)條件下，膠質(zhì)瘤細胞呈現(xiàn)明顯的形態(tài)學變化，總體上是從成熟變得“幼稚”，表現(xiàn)為細胞器減少、膠質(zhì)纖維絲消失、細胞核仁的出現(xiàn)等；缺氧顯著增強瘤細胞克隆形成能力，增加緊密型克隆形成的比例；缺氧增強瘤細胞的遷

11、移能力；流式細胞檢測顯示缺氧顯著提高CD133陽性細胞比例；缺氧條件下干細胞標志物mRNA及蛋白水平明顯上調(diào)，而GFAP表達明顯減弱；總體上缺氧對瘤細胞生長、細胞周期及凋亡的影響并不明顯。
　　4.缺氧調(diào)控膠質(zhì)瘤干細胞“干性”的體外研究：采用條件培養(yǎng)基壓力篩選成功獲得膠質(zhì)瘤干細胞克隆球，后者高表達干細胞標志物；缺氧培養(yǎng)下，GSCs克隆球形成比例及大小均明顯增加，而克隆球向膠質(zhì)細胞的分化明顯受抑；缺氧培養(yǎng)使得GSCs CD133陽性

12、細胞比例明顯增高，干細胞標記物Oct-4及Sox-2蛋白表達上調(diào)。
　　5. Notch信號通路在缺氧誘導的GSCs“干性”調(diào)節(jié)中的作用：缺氧處理后GSCs Notch信號關(guān)鍵分子(Notch1，Notch1 ICD，Hes-1)蛋白表達明顯上調(diào)；以DAPT處理后，GSCs Notch1蛋白水平顯著下降，呈現(xiàn)梯度依賴性，5ug/ml DAPT對Notch1蛋白表達的抑制率達80％；以5ug/ml DAPT處理各組GSCs，可顯著抑

13、制缺氧對GSCs克隆形成增強的誘導作用，降低克隆形成數(shù)目，形成的克隆體積也明顯縮小。同時可部分抵消缺氧誘導的GSCs分化抑制作用。
　　結(jié)論:
　　1.缺氧標志物CA IX在惡性膠質(zhì)瘤過度表達，其高表達意味著較高的組織學分級及預(yù)后不良，CA IX介導的腫瘤惡性進展可能與瘤細胞“干性”增強及侵襲力的增加有關(guān)；
　　2.我們首次證實了在惡性膠質(zhì)瘤組織中CA IX陽性區(qū)域存在更多干細胞樣表型的瘤細胞，而且切割的CA IX(+