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文檔簡介
1、星形細(xì)胞腫瘤是顱內(nèi)最為常見的原發(fā)性腫瘤之一,占所有顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤的60%以上。盡管采取了包括外科手術(shù)及放化療在內(nèi)的綜合性治療措施,星形細(xì)胞瘤的預(yù)后仍然很差,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的平均生存時間仍不足一年。越來越多的證據(jù)表明,癌癥是一種干細(xì)胞疾病。癌癥干細(xì)胞,或稱為干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞,是腫瘤組織中的一小群具有無限自我更新能力、多向分化潛能的特殊細(xì)胞群體。癌癥干細(xì)胞具有重要的生物學(xué)及治療學(xué)意義,它們被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、演進及復(fù)發(fā)的細(xì)胞源泉。惡性膠質(zhì)瘤是最
2、早被證實存在癌癥干細(xì)胞的實體腫瘤之一,我們課題組前期亦從腦膠質(zhì)瘤新鮮組織及已建立的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,如U87及U251細(xì)胞中分離得到膠質(zhì)瘤干細(xì)胞并在體外成功培養(yǎng)和鑒定。癌癥干細(xì)胞,如同其相對應(yīng)的成體干細(xì)胞一樣,也需要某種特定的微環(huán)境,即niche,以維持其自我更新能力,保持未分化狀態(tài)。
缺氧是包括惡性膠質(zhì)瘤在內(nèi)的實體腫瘤的基本特征之一。缺氧通過激活多種信號通路,促進細(xì)胞存活、增加瘤細(xì)胞運動能力、促進腫瘤新生血管化,從而在腫瘤惡性進
3、展中發(fā)揮重要作用。新近有證據(jù)表明,缺氧可能是構(gòu)成膠質(zhì)瘤干細(xì)胞微環(huán)境的關(guān)鍵組分之一。缺氧在體外可維持腫瘤干細(xì)胞自我更新能力,保持其處于未分化狀態(tài),但到目前關(guān)于缺氧與腫瘤干細(xì)胞關(guān)系的研究均系體外研究,尚缺乏來自臨床腫瘤樣本的直接證據(jù);此外,缺氧調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞“干性”的分子機制尚缺乏研究。
研究目的:
1.探討缺氧標(biāo)記物CA IX在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)規(guī)律及表達(dá)模式,重點觀測CA IX表達(dá)與腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)之間的關(guān)系;<
4、br> 2.探討惡性膠質(zhì)瘤組織中CA IX表達(dá)的臨床病理學(xué)意義,評價其作為預(yù)后指標(biāo)的應(yīng)用價值;
3.探討缺氧對惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞功能的影響,重點觀測缺氧對細(xì)胞形態(tài)、克隆形成、干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)及分化的作用,以證明缺氧可誘導(dǎo)已分化瘤細(xì)胞去分化,獲得干細(xì)胞特性;
4.探討缺氧對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新、分化及干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響,以證明缺氧可維持或增強膠質(zhì)瘤干細(xì)胞“干性”;
5.初步探討Notch信號在缺氧誘導(dǎo)的GS
5、Cs“干性”維持或增強中的作用。
研究內(nèi)容和方法:
1.缺氧標(biāo)記物CA IX在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)研究:以人惡性膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本為研究材料,采用免疫激光捕獲顯微切割(i-LCM)、免疫組化及雙標(biāo)免疫熒光、激光共聚焦顯微術(shù)、實時定量PCR等技術(shù),觀測CA IX在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)模式,評價其臨床病理學(xué)意義及與患者預(yù)后的關(guān)系,并著重探討CA IX表達(dá)與GSCs標(biāo)志物表達(dá)之間的關(guān)系。
2.缺氧對惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞“干性”
6、調(diào)節(jié)的體外研究:以U87、U251細(xì)胞系及3例原代培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞為研究材料,建立缺氧培養(yǎng)模型,采用透射電鏡觀測瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化;MTT法檢測缺氧對生長的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期;Transwell小室檢測細(xì)胞遷移;克隆形成實驗檢測瘤細(xì)胞克隆形成能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測CD133表達(dá);分別采用實時定量PCR和Western blot檢測干細(xì)胞標(biāo)志物及分化標(biāo)志物mRNA和蛋白表達(dá)。
3.缺氧調(diào)控膠質(zhì)瘤干細(xì)胞“干性”的體
7、外研究:運用條件培養(yǎng)基壓力篩選的方法從上述膠質(zhì)瘤細(xì)胞中分離培養(yǎng)干細(xì)胞樣克隆球,并進行干細(xì)胞標(biāo)志物鑒定;采用干細(xì)胞克隆形成實驗和分化實驗分別觀測缺氧對GSCs自我更新及分化的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測CD133表達(dá);免疫熒光檢測干細(xì)胞及分化標(biāo)志物表達(dá);Western blot檢測干細(xì)胞標(biāo)志物蛋白表達(dá);
4. Notch信號通路在缺氧誘導(dǎo)的GSCs“干性”調(diào)節(jié)中作用的初步研究:采用Western blot檢測缺氧對GSCs Notch信
8、號關(guān)鍵分子表達(dá)的影響;以Notch信號特異性抑制劑DAPT處理細(xì)胞,檢測其對Notch1的抑制作用,確定合適的濃度(5μg/ml);采用干細(xì)胞克隆形成及分化實驗觀測DAPT對缺氧誘導(dǎo)的GSCs“干性”增強及分化抑制的拮抗作用。
研究結(jié)果:
1.缺氧標(biāo)記物CA IX在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義:CA IX在惡性膠質(zhì)瘤中呈過度表達(dá),多表達(dá)于高級別膠質(zhì)瘤壞死灶周邊及低級別膠質(zhì)瘤侵襲性邊沿的瘤細(xì)胞。CA IX表達(dá)與
9、腫瘤組織學(xué)分級及大小關(guān)系密切;CA IX(++)組患者的總體生存期及無疾病進展生存期均顯著低于CA IX(+)及CA IX(-)組患者(p<0.001);多因素分析顯示CA IX(++)(p<0.001)為預(yù)后差的獨立預(yù)測指標(biāo)。
2.缺氧標(biāo)記物CA IX表達(dá)與干細(xì)胞、侵襲標(biāo)志物表達(dá)之間的關(guān)系:雙標(biāo)免疫熒光檢測顯示CA IX陽性區(qū)域表達(dá)CD133、Oct4、Sox2及CXCR4的瘤細(xì)胞數(shù)目均分別顯著高于臨近的CA IX陰性區(qū)域,
10、而CA IX的表達(dá)與p53及Ki-67無關(guān);顯微切割獲得的CA IX陽性瘤細(xì)胞CA IX、Oct4、Sox2及CXCR4 mRNA水平明顯高于相對應(yīng)的臨近CA IX陰性瘤細(xì)胞。
3.缺氧對惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞“干性”調(diào)節(jié)的體外研究:缺氧培養(yǎng)條件下,膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化,總體上是從成熟變得“幼稚”,表現(xiàn)為細(xì)胞器減少、膠質(zhì)纖維絲消失、細(xì)胞核仁的出現(xiàn)等;缺氧顯著增強瘤細(xì)胞克隆形成能力,增加緊密型克隆形成的比例;缺氧增強瘤細(xì)胞的遷
11、移能力;流式細(xì)胞檢測顯示缺氧顯著提高CD133陽性細(xì)胞比例;缺氧條件下干細(xì)胞標(biāo)志物mRNA及蛋白水平明顯上調(diào),而GFAP表達(dá)明顯減弱;總體上缺氧對瘤細(xì)胞生長、細(xì)胞周期及凋亡的影響并不明顯。
4.缺氧調(diào)控膠質(zhì)瘤干細(xì)胞“干性”的體外研究:采用條件培養(yǎng)基壓力篩選成功獲得膠質(zhì)瘤干細(xì)胞克隆球,后者高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物;缺氧培養(yǎng)下,GSCs克隆球形成比例及大小均明顯增加,而克隆球向膠質(zhì)細(xì)胞的分化明顯受抑;缺氧培養(yǎng)使得GSCs CD133陽性
12、細(xì)胞比例明顯增高,干細(xì)胞標(biāo)記物Oct-4及Sox-2蛋白表達(dá)上調(diào)。
5. Notch信號通路在缺氧誘導(dǎo)的GSCs“干性”調(diào)節(jié)中的作用:缺氧處理后GSCs Notch信號關(guān)鍵分子(Notch1,Notch1 ICD,Hes-1)蛋白表達(dá)明顯上調(diào);以DAPT處理后,GSCs Notch1蛋白水平顯著下降,呈現(xiàn)梯度依賴性,5ug/ml DAPT對Notch1蛋白表達(dá)的抑制率達(dá)80%;以5ug/ml DAPT處理各組GSCs,可顯著抑
13、制缺氧對GSCs克隆形成增強的誘導(dǎo)作用,降低克隆形成數(shù)目,形成的克隆體積也明顯縮小。同時可部分抵消缺氧誘導(dǎo)的GSCs分化抑制作用。
結(jié)論:
1.缺氧標(biāo)志物CA IX在惡性膠質(zhì)瘤過度表達(dá),其高表達(dá)意味著較高的組織學(xué)分級及預(yù)后不良,CA IX介導(dǎo)的腫瘤惡性進展可能與瘤細(xì)胞“干性”增強及侵襲力的增加有關(guān);
2.我們首次證實了在惡性膠質(zhì)瘤組織中CA IX陽性區(qū)域存在更多干細(xì)胞樣表型的瘤細(xì)胞,而且切割的CA IX(+
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