鼻咽癌腫瘤干細胞mTOR通路的激活及雷帕霉素的抗腫瘤效應.pdf

1、目的:
　　通過檢測鼻咽癌組織、細胞中mTOR(mammalian target of rapamycin)信號通路蛋白及腫瘤干細胞標記CD133、SOX2和OCT4的表達，探討mTOR信號通路在鼻咽癌細胞中是否激活及鼻咽癌中是否存有腫瘤干細胞。進一步檢測鼻咽癌中的腫瘤干細胞mTOR通路是否激活。再用mTOR通路抑制劑雷帕霉素探測其對體外、體內移植的鼻咽癌細胞及干細胞的生長增殖是否抑制，及其對mTOR通路活性蛋白表達的調控作用。<

2、br>　　方法:
　　1.免疫組織化學檢測鼻咽癌組織、細胞中及裸鼠移植腫瘤組織中腫瘤干細胞標記CD133、多潛能干細胞標記SOX2和OCT4及mTOR信號通路中四種代表蛋白mTOR、S6、pmTOR和pS6的表達情況。其中pS6和pmTOR是mTOR信號通路的活化形式。
　　2.免疫熒光雙染色法檢測鼻咽癌細胞及裸鼠移植腫瘤組織中mTOR信號通路蛋白與CD133、SOX2共表達情況。
　　3.用CCK8對預先用不同濃度雷

3、帕霉素處理和溶劑對照處理48和72小時后的原代鼻咽癌細胞的增殖情況進行檢測。
　　4.將原代培養(yǎng)的第15代鼻咽癌細胞注入裸鼠體內使成瘤，同時腹腔注射雷帕霉素處理和對照溶劑14天，檢測裸鼠腫瘤生長情況及大小質量。
　　5.Western blot技術檢測預先用不同濃度雷帕霉素處理和溶劑對照處理48小時后的原代鼻咽癌細胞及裸鼠移植腫瘤組織中mTOR信號通路中蛋白S6、4E-BP1、mTOR、pS6、pmTOR和p4E-BP1的相

4、對表達量。
　　6.統(tǒng)計學處理:結果用均數(shù)±標準差(M±SD)表示。組織中免疫組化陽性表達率采用非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗，不同濃度雷帕霉素抑制細胞生長采用One-way ANOVA方差分析，多重比較采用LSD法，裸鼠移植瘤大小、質量比較及移植瘤組織中對照與藥物組之間蛋白相對表達量用獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.鼻咽癌組織中腫瘤干細胞標記CD133、多潛能干細胞標記SOX2和O

5、CT4的表達比鼻咽炎組織高，有統(tǒng)計學意義;鼻咽癌細胞中及裸鼠移植腫瘤組織中CD133、SOX2、OCT4及mTOR、S6、pmTOR和pS6呈陽性表達。
　　2.免疫熒光雙染色顯示鼻咽癌細胞及裸鼠移植腫瘤組織中mTOR信號通路蛋白與CD133、SOX2共表達。
　　3.用雷帕霉素濃度分別為0、10、20、30、40、50、100nmol/L處理的原代鼻咽癌細胞48和72小時后，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的加大，相應的癌細胞生存率依次下

6、降;而相同濃度雷帕霉素72小時處理過的癌細胞比處理48小時的生存率要低。
　　4.裸鼠移植瘤，相對于溶劑對照組，雷帕霉素處理組腫瘤大小、質量受抑制有統(tǒng)計學意義。
　　5.Western blot檢測光密度結果顯示，當雷帕霉素濃度分別為0，30，50，100nmol/L時，隨著藥物濃度的增加，活性形式的pmTOR蛋白的表達量逐漸下降，而pS6雷帕霉素處理后未能檢出。相對于溶劑對照組，雷帕霉素處理組的移植瘤大小和質量減小及蛋白p

7、mTOR和p4E-BP1表達下降都有統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　1.鼻咽癌組織中CD133、SOX2、OCT4、mTOR、S6、pmTOR和pS6呈陽性表達，說明mTOR信號通路在人類原發(fā)鼻咽癌中被激活，且鼻咽癌組織中有腫瘤干細胞。免疫熒光雙染色法檢測鼻咽癌細胞及裸鼠移植腫瘤組織中mTOR信號通路蛋白與CD133、SOX2共表達，說明腫瘤干細胞中mTOR信號通路被激活。
　　2.Western blot檢測結果顯示，

8、體外實驗中雷帕霉素能夠下調鼻咽癌細胞中pS6、pmTOR蛋白的表達，而且該作用在一定范圍內呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　3.CCK8檢測不同濃度雷帕霉素處理48h和72小時后細胞的存活情況，結果說明在一定范圍內，鼻咽癌細胞增殖受雷帕霉素抑制有濃度和時間依賴性。
　　4.體內實驗說明雷帕霉素不僅能抑制mTOR信號通路，而且可以抑制腫瘤的生長和增殖。
　　5.由此推斷，mTOR信號通路在人類鼻咽癌干細胞中被激活，而且在生長、增殖過