HMGB1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響.pdf

1、研究背景和目的：
　　高遷移率族蛋白1（high mobility group box1,HMGB1）是存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的一類非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，參與基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、V( D) J重組、細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、核小體的構(gòu)建、細(xì)胞的增殖、分化、遷移及凋亡，腫瘤的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移和浸潤等。HMGB1含有215個氨基酸殘基，高度保守。HMGB1由三個不同的結(jié)構(gòu)域組成：兩個HMG box結(jié)構(gòu)域以及一個由30個氨基酸組成的C末端。HM

2、GB1能與DNA結(jié)合，通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)架構(gòu)（染色體中由非組蛋白構(gòu)成的結(jié)構(gòu)支架）進(jìn)而調(diào)控翻譯、修復(fù)和重組。在細(xì)胞受到刺激、細(xì)胞死亡、凋亡，組織缺氧及缺血再灌注時，HMGB1可以被釋放到細(xì)胞外，參與炎癥、細(xì)胞遷移、分化和血管發(fā)生。
　　許多研究顯示：HMGB1可參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，其可能的機制包括HMGB1的高表達(dá)引起某些基因表達(dá)失調(diào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞具有腫瘤表型；此外， HMGB1的高表達(dá)還可使獲得腫瘤表型的細(xì)胞免于凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤的

3、發(fā)生。在結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌及食道癌等多種腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)了 HMGB1的高表達(dá)，同時也伴隨有晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）的表達(dá)。RAGE是HMGB1的受體，通過JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對HMGB1的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)節(jié)效應(yīng)。
　　膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma, GBM）是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，具有很高的致死率，其主要原因是由于

4、腫瘤細(xì)胞的高浸潤性和轉(zhuǎn)移性。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WorldHealth Organization,WHO）所定標(biāo)準(zhǔn)，膠質(zhì)瘤的病理分型可分為四級：I級是毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤、II級是彌漫性星形細(xì)胞瘤、III級為間變型星形細(xì)胞瘤、IV級為多形性GBM，其中I級和II級為低級別，屬良性腫瘤，Ⅲ級和IV級為高級別，屬惡性腫瘤。近些年來，針對膠質(zhì)瘤的治療雖然在手術(shù)、放化療方面取得了很大進(jìn)步，但由于腫瘤細(xì)胞的侵襲性、血腦屏障的不通透性以及對腫瘤細(xì)胞來源

5、和其生長機制的不明確性，大大局限了治療的有效性。
　　有研究通過檢測人腦膠質(zhì)瘤組織中HMGB1基因的表達(dá)水平，探討其與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，結(jié)果顯示：HMGB1 mRNA的表達(dá)水平在膠質(zhì)瘤組明顯高于對照組，但在低級別組與高級別組中的表達(dá)水平無顯著差異。也有研究顯示：高表達(dá)HMGB1的腫瘤細(xì)胞或者壞死的腫瘤細(xì)胞可將HMGB1釋放到細(xì)胞外，促使周圍腫瘤細(xì)胞的增殖，同時誘導(dǎo)小血管的再生，從而促使腫瘤的不斷生長；給予HMGB1或RAGE抑

6、制劑，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。
　　目前對于HMGB1在人膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)與定位及其作用尚不完全清楚，如：HMGB1在各級膠質(zhì)瘤中的表達(dá)程度是否相同；表達(dá)在胞核還是胞漿；表達(dá)在何種類型細(xì)胞中；HMGB1是否影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、存活、凋亡和自噬，以及具體的機制是什么等問題尚待解決。因此，本課題的研究目的是闡明HMGB1在各級膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)程度，細(xì)胞定位與表達(dá)的細(xì)胞類型，初步探討 HMBG1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞線粒體的形態(tài)、細(xì)胞的凋亡與

7、自噬的影響，為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供理論依據(jù)。
　　研究材料：
　　選自中國人民解放軍第153中心醫(yī)院病理科提供的各級膠質(zhì)瘤組織的石蠟標(biāo)本，這些標(biāo)本均來自該院神經(jīng)外科膠質(zhì)瘤患者手術(shù)切除的組織，其中低級別標(biāo)本（I～Ⅱ）12例，高級別標(biāo)本（Ⅲ～Ⅳ）15例。
　　細(xì)胞實驗所用到的細(xì)胞系為 U87-MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，購置于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。
　　研究方法：
　　1.免疫組化單標(biāo)記或雙標(biāo)記染色，觀察HMGB1在各級別膠

8、質(zhì)瘤中的表達(dá)程度、細(xì)胞定位及表達(dá)的細(xì)胞類型。
　　2.質(zhì)粒的構(gòu)建及抽提：通過上海生工生物公司合成過表達(dá) HMGB1的質(zhì)粒， HMGB1連接在pEGFP-C1載體上（HMGB1與 EGFP融合表達(dá)），對照載體是pEGFP-C1空載體。使用BIOMIGA無內(nèi)毒質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒抽提質(zhì)粒。3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：應(yīng)用Simple-Fect Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒將過表達(dá)HMGB1的質(zhì)粒和空對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U87-MG

9、細(xì)胞，1）提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Western Blotting（WB）實驗，觀察構(gòu)建的質(zhì)粒能否過表達(dá)HMGB1；2）用細(xì)胞免疫熒光法觀察過表達(dá)HMGB1是否影響線粒體的形態(tài)、細(xì)胞的凋亡或自噬。
　　4.用促炎因子LPS&IFN-γ聯(lián)合刺激U87-MG細(xì)胞，提取蛋白，進(jìn)行WB實驗，檢測炎癥是否影響HMGB1的表達(dá)。
　　5.統(tǒng)計學(xué)分析：數(shù)據(jù)采用SPSS17.0或Origin70軟件分析，具體分析方法為卡方檢驗以及單因素方差分析（

10、One-Way ANOVA），數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示。
　　結(jié)果：
　　1.高級別膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，HMGB1高表達(dá)的標(biāo)本比例顯著高于低級別標(biāo)本中的高表達(dá)比例（χ2=7.56，P=0.01）；對于HMGB1中等程度表達(dá)的標(biāo)本比例（χ2=1.17，P=0.18）以及低表達(dá)的標(biāo)本比例（χ2=1.93，P=0.13），兩個級別間未出現(xiàn)顯著差異。
　　2. HMGB1的陽性信號主要定位在胞核，偶見在一些細(xì)胞的胞

11、漿中也有HMGB1的陽性信號。在低級別和高級別組織中，HMGB1在胞核中表達(dá)的細(xì)胞比例均顯著高于在胞漿中表達(dá)的細(xì)胞比例（低級別P=0.00797；高級別P=0.00130）；而將低級別和高級別在胞核與胞漿的相應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，均未檢測到有顯著差異（胞核P=0.79254；胞漿P=0.44251）。此外，隨著膠質(zhì)瘤級別的增加，HMGB1的表達(dá)出現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)或分頁形態(tài)，而在低級別膠質(zhì)瘤組織中，HMGB1的表達(dá)為均勻的圓形或橢圓形。
　　

12、3.各級膠質(zhì)瘤組織中，在膠質(zhì)瘤相關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP標(biāo)記）、膠質(zhì)瘤相關(guān)干細(xì)胞（Nestin標(biāo)記）、小膠質(zhì)細(xì)胞（Iba1標(biāo)記）、血管內(nèi)皮樣細(xì)胞以及神經(jīng)元樣細(xì)胞中均有HMGB1的陽性表達(dá)。
　　4．高級別膠質(zhì)瘤中先天免疫細(xì)胞小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的活化狀態(tài)（突起回縮，胞體增大和變圓），此外，炎性因子IL-6的表達(dá)明顯增加（P=0.0178）。采用促炎因子LPS和IFN-γ聯(lián)合刺激U87-MG細(xì)胞，HMGB1的蛋白表達(dá)量增加。

13、　　5. HMGB1在U87-MG中，主要表達(dá)在胞核，核仁分布更為明顯。
　　6. HMGB1過表達(dá)導(dǎo)致U87-MG細(xì)胞中線粒體發(fā)生斷裂；未發(fā)現(xiàn)HMGB1過表達(dá)對LC3B以及Caspase3表達(dá)的影響。
　　結(jié)論：
　　1.隨著膠質(zhì)瘤級別的增加，HMGB1的表達(dá)增加；HMGB1主要表達(dá)在胞核，并且隨著級別增加，HMGB1出現(xiàn)多形性分布；HMGB1在膠質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、血管樣細(xì)胞以及神經(jīng)元樣細(xì)胞中均有表達(dá)。<