雷帕霉素對(duì)絨癌JEG-3細(xì)胞株的影響及其機(jī)制初探.pdf

1、的:
　　 用雷帕霉素對(duì)人絨癌細(xì)胞株JEG-3進(jìn)行處理,探討其對(duì)JEG-3的作用。分別采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell技術(shù)檢測(cè)雷帕霉素處理前后JEG-3細(xì)胞在增殖、凋亡和侵襲能力的改變,為臨床治療絨癌打下體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。
　　 運(yùn)用RT-PCR,Western-blot檢測(cè)雷帕霉素對(duì)其靶點(diǎn)mTOR的RNA和蛋白表達(dá)量的影響;用Western-blot檢測(cè)雷帕霉素處理前后mTOR及調(diào)控的下游蛋白P-4EBP1和

2、 P-p70S6K的蛋白表達(dá)量的變化。初步探討引起增殖、凋亡和侵襲能力的改變的分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)分組:第1組為對(duì)照組細(xì)胞不加任何藥物處理；第2組為加0.01％的DMSO；第3、4、5、6組加雷帕霉素處理組,藥物濃度依次為0.1,1,10,100ng/ml。
　　 3.MTT法:用于檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖情況。
　　 4.流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù):用于檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)

3、組細(xì)胞凋亡情況。
　　 5.Transwell實(shí)驗(yàn):檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞侵襲能力。
　　 6.RT-PCR:檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組mTOR mRNA表達(dá)量。
　　 7.Western Blot:檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組mTOR、P-4EBP1和P-p70S6K蛋白表達(dá)量。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT法檢測(cè)結(jié)果
　　 結(jié)果顯示雷帕霉素對(duì)JEG-3的增殖有抑制作用(F=8.46,P<0.05),濃度0.1,

4、1,10ng/ml組,隨著濃度的增加抑制越明顯,而10ng/ml和100ng/ml處理組無(wú)差異。對(duì)照組加0.1％DMSO和未加任何藥物處理的細(xì)胞吸光度無(wú)差異(P>0.05)。
　　 2.流式技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果
　　 0.1,1,10ng/ml處理組隨濃度梯度的增加凋亡率增加(F=7.29,P<0.05),10ng/ml和100ng/ml處理組無(wú)差異。通過(guò)Dunnett組間比較發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和加DMSO組之間無(wú)顯著差異(P

5、=0.083)。
　　 3.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 結(jié)果顯示100ng/ml處理組絨癌細(xì)胞侵襲能力下降,明顯低于對(duì)照組(F=4.24,P<0.05)；對(duì)照組和DMSO組無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　 4.mTOR的RT-PCR和Western結(jié)果
　　 100ng/ml雷帕霉素處理的mTOR RNA量和蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯變化。
　　 5.P-4EBP1,P-p70S6K

6、的Western blot結(jié)果
　　 藥物處理組隨濃度的增加P-4EBP1,P-p70S6K均有明顯下降。將3、4、5、6組分別與對(duì)照組組兩兩比較均有顯著差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞技術(shù)和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雷帕霉素處理組與對(duì)照組相比,細(xì)胞增殖明顯降低、細(xì)胞凋亡明顯增加和侵襲能力明顯減弱。
　　 2.在MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)中還發(fā)現(xiàn),雷帕霉素濃

7、度都在0.1-10ng/ml之間隨著濃度的增加抑制率和凋亡率都增加,而10ng/ml和100ng/ml濃度相比較抑制率和凋亡率差異不顯著。說(shuō)明10ng/ml的雷帕霉素對(duì)絨癌JEG-3的影響達(dá)到了最大效應(yīng),即雷帕霉素對(duì)于絨癌細(xì)胞株的影響具有劑量依耐性。
　　 3.通過(guò)RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)mTOR的RNA總量和蛋白量隨藥物濃度梯度的增加變化不明顯,說(shuō)明雷帕霉素并不直接作用于mTOR的RNA和蛋白表達(dá)水平,