miR-218對膠質(zhì)瘤抑瘤作用及其機制的研究.pdf

1、[目的]microRNA-218(miR-218)是一種重要的抑瘤微小RNA(miRNA)，其表達異常可見于多種實體腫瘤及癌前病變。本室前期研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤miR-218表達水平隨其良惡性程度升高而相應降低，提示其表達減少或缺失可能在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。生物信息學預測顯示細胞周期蛋白依賴性激酶6(CDK6)是miR-218的潛在靶基因，且膠質(zhì)瘤CDK6表達水平隨其良惡性程度升高而相應增加，但在膠質(zhì)瘤細胞中二者表達變化的確切關(guān)系

2、如何，尚待進一步證實。本研究旨在觀察miR-218在惡性膠質(zhì)瘤細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及誘導細胞成熟分化方面的作用，證實CDK6是否miR-218的天然靶基因，探討miR-218特異性敲低CDK6表達是否是該miRNA發(fā)揮抑瘤作用的分子機制。
　　[方法]①通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和G418篩選建立過表達miR-218的U87MG和SNB-19亞細胞系及對照亞細胞系，采用stem-loopqRT-PCR比較各亞細胞系中miR-218的表達水

3、平。②采用熒光素酶實驗、qRT-PCR及Westernblot驗證CDK6是否是miR-218的天然靶基因，探討miR-218敲低CDK6表達的機制。③利用Ki-67免疫細胞化學染色及克隆形成實驗比較各亞細胞系細胞增殖活性，通過流式細胞術(shù)(FCM)和cyclinD1、cyclinE、cyclinA、CDK4、CDK6等細胞周期調(diào)節(jié)蛋白的Westernblot檢測比較各亞細胞系細胞周期分布情況，分析miR-218誘導細胞周期阻滯和增殖抑制

4、的分子機制。④通過Caspase3/7活性檢測及FCM比較miR-218過表達亞細胞系及miR-218mimics轉(zhuǎn)染細胞凋亡水平的改變，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染補充外源性CDK6，觀察CDK6對miR-218促凋亡作用的影響，以進一步驗證miR-218特異性下調(diào)CDK6表達在其促凋亡作用中的意義。⑤利用體外遷移侵襲實驗、Matrigel3D培養(yǎng)及定量侵襲實驗比較miR-218表達水平不同亞細胞系遷移侵襲能力的差異，通過補充外源性CDK6探討特異性

5、敲低CDK6是否是miR-218抑制腫瘤細胞遷移侵襲的分子機制。⑥利用Westernblot及免疫細胞化學染色檢測不同亞細胞系CD133、Nestin及GFAP表達的差異，觀察miR-218在惡性膠質(zhì)瘤細胞系及膠質(zhì)瘤干細胞(GSCs)成熟分化中的作用；利用免疫熒光觀察miR-218下調(diào)CD133及Nestin表達的特異性；通過觀察補充外源性CDK6對miR-218促分化作用的影響探討特異性敲低CDK6是否是miR-218促進腫瘤細胞成熟

6、分化的分子機制。
　　[結(jié)果]①成功構(gòu)建了過表達miR-218的U87MG及SNB-19膠質(zhì)母細胞瘤亞細胞系，并經(jīng)stem-loopqRT-PCR證實其miR-218的表達量分別是對照亞細胞系的11.58±2.39倍及26.23±8.08倍。②熒光素酶實驗結(jié)果顯示，miR-218可通過與熒光素酶mRNA下游連接的CDK63’UTR結(jié)合，特異性降低熒光素酶的表達水平，證實CDK6是miR-218的天然靶基因；qRT-PCR及West

7、ernblot結(jié)果顯示，miR-218過表達亞細胞系CDK6mRNA及蛋白表達水平均明顯低于對照亞細胞系。③miR-218過表達亞細胞系Ki-67陽性標記指數(shù)(LI)和克隆形成效率均明顯低于對照亞細胞系，其cyclinD1表達水平明顯高于對照亞細胞系，cyclinE、cyclinA表達水平明顯低于后者，而CDK4的表達水平無明顯差異；FCM結(jié)果顯示，miR-218過表達亞細胞系G1期細胞比例增高，而S期及G2/M期細胞比例相應減少。④m

8、iR-218過表達亞細胞系Caspase3/7活性明顯高于對照亞細胞系，miR-218mimics轉(zhuǎn)染的U87MG及SNB-19細胞其凋亡指數(shù)明顯高于無義對照序列轉(zhuǎn)染細胞。外源性CDK6不能降低miR-218過表達亞細胞系的Caspase3/7活性及miR-218mimics轉(zhuǎn)染細胞的凋亡指數(shù)。⑤遷移、侵襲實驗結(jié)果及3D培養(yǎng)結(jié)果均顯示，miR-218可有效抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞系的遷移和侵襲能力，外源性CDK6可部分逆轉(zhuǎn)miR-218對腫

9、瘤細胞遷移侵襲的影響。⑥miR-218過表達亞細胞系中CD133及Nestin表達水平明顯低于對照亞細胞系，而GFAPLI明顯高于后者。外源性CDK6可部分逆轉(zhuǎn)miR-218過表達造成的上述蛋白的表達變化；免疫熒光檢測顯示，CD133和Nestin表達降低特異性地發(fā)生于成功轉(zhuǎn)染miR-218表達質(zhì)粒且表達EGFP報導基因的腫瘤細胞。
　　[結(jié)論]①本研究建立的miR-218過表達亞細胞系可穩(wěn)定高表達miR-218。②CDK6是mi

10、R-218的天然靶基因，miR-218可通過降解其mRNA和阻斷其翻譯過程在轉(zhuǎn)錄后和翻譯兩個水平特異性敲低CDK6的表達。③CDK6是易化惡性膠質(zhì)瘤細胞G1/S過渡的重要激酶，miR-218可通過敲低CDK6表達誘導G1期阻滯，并進而抑制惡性膠質(zhì)瘤細胞的增殖活性。④miR-218可誘導惡性膠質(zhì)瘤細胞的凋亡，但該作用與其阻斷CDK6表達無關(guān)。⑤miR-218可有效抑制惡性膠質(zhì)瘤細胞的遷移和侵襲，CDK6表達下調(diào)是miR-218抑制遷移侵襲