炎癥刺激對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞線粒體影響的研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma, GBM）是腦腫瘤中最常見(jiàn)和最致命的惡性腫瘤，占所有腦腫瘤的17％，每年有超過(guò)10,000個(gè)新的GBM病例在美國(guó)被診斷，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，國(guó)內(nèi)膠質(zhì)瘤年發(fā)病率約為3~6人/10萬(wàn)人，且近三十年來(lái)發(fā)生率逐年遞增，在35歲以下腫瘤患者中死亡率排名第二。GBM跟其他腦腫瘤相比同樣會(huì)導(dǎo)致癲癇、惡心、嘔吐、頭痛和輕微偏癱，其中最重要的癥狀是不斷惡化的記憶、性格或神經(jīng)衰退。GBM預(yù)后不佳，

2、具有很高的致死率，其主要原因是由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有高侵潤(rùn)性和轉(zhuǎn)移性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，51%的薄壁組織腦腫瘤和20%的顱內(nèi)腦腫瘤都是GBM。近些年來(lái)，針對(duì)GBM的治療雖然在手術(shù)、化放療方面取得了很大進(jìn)步，但關(guān)于GBM細(xì)胞的高侵襲性機(jī)制、血腦屏障對(duì)GBM細(xì)胞的影響、GBM生長(zhǎng)機(jī)制與發(fā)生發(fā)展的個(gè)體差異等問(wèn)題仍然需要回答。
　　炎癥反應(yīng)在腫瘤的發(fā)生、癌細(xì)胞的增殖、血管的生成、腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等方面起關(guān)鍵作用。與腫瘤相關(guān)的炎癥的典型特征是先天免疫

3、細(xì)胞（如小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的浸潤(rùn)、細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，組織重塑和血管生成。炎癥反應(yīng)一方面誘導(dǎo)氧和氮自由基的產(chǎn)生，破壞細(xì)胞DNA和膜結(jié)構(gòu)；另一方面激活與癌細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)展以及侵襲相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路。
　　線粒體是哺乳動(dòng)物體內(nèi)除細(xì)胞核外唯一含有遺傳信息的細(xì)胞器。它們不斷地通過(guò)分裂、融合、出芽以及亞結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)行遺傳物質(zhì)交換、形態(tài)及數(shù)量變化。有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體分裂和融合的穩(wěn)態(tài)與腫瘤的增殖有一定相關(guān)性，但這種線粒體分裂和融合的穩(wěn)

4、態(tài)在GBM細(xì)胞中的起何種作用尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，因此明確線粒體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能變化與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性十分必要。
　　細(xì)胞自噬是真核生物代謝的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，以清除受損或多余的細(xì)胞器或蛋白質(zhì)。近些年對(duì)自噬的研究取得了一定的進(jìn)展，但自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵潤(rùn)過(guò)程中起促進(jìn)作用還是抑制作用至今尚未見(jiàn)定論。另外炎癥環(huán)境中，GBM細(xì)胞內(nèi)線粒體是否存在自噬、線粒體穩(wěn)態(tài)有無(wú)異常、以及線粒體功能是否發(fā)生紊亂尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　因此，本研究通過(guò)細(xì)

5、胞培養(yǎng)、蛋白質(zhì)印記、免疫組化、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和透射電鏡等主要技術(shù)手段研究：膠質(zhì)瘤細(xì)胞中線粒體的形態(tài)、生物學(xué)性能以及質(zhì)量控制與炎癥的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示GBM的發(fā)病機(jī)制，尋求有效的治療方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料和方法:
　　第一部分：促炎因子刺激對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中線粒體形態(tài)學(xué)的影響
　　1.對(duì)各級(jí)別膠質(zhì)瘤組織切片進(jìn)行Ibal免疫組化染色，觀察各級(jí)膠質(zhì)瘤中小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和分布的變化。
　　2.對(duì)各級(jí)別膠

6、質(zhì)瘤組織切片進(jìn)行IL-6免疫組化染色，觀察在各級(jí)膠質(zhì)瘤中促炎因子IL-6的表達(dá)情況。
　　3.用促炎因子LPS和IFN-γ聯(lián)合刺激U87-MG細(xì)胞，分為0h、4h、8h、24h組，進(jìn)行Western Blotting（WB）和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)Drp1、Mfn2與Hsp60蛋白表達(dá)量的改變，以及線粒體形態(tài)的改變。
　　第二部分：促炎因子刺激對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中線粒體生物學(xué)性能的影響
　　1.使用活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)在

7、LPS和IFN-γ聯(lián)合刺激下，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ROS的變化。
　　2.使用4-羥基壬烯酸（HNE）標(biāo)記細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，觀察在 LPS和 IFN-γ聯(lián)合刺激下U87-MG中線粒體膜脂質(zhì)過(guò)氧化水平的變化。
　　3.使用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）檢測(cè)在LPS和IFN-γ聯(lián)合刺激下， U87-MG中線粒體膜電位的改變。
　　4.使用NAC（N-Acetyl-L-cysteine）作為ROS抑制劑，抑制促炎因子刺激下U87-

8、MG中ROS的產(chǎn)生，觀察線粒體形態(tài)的變化。
　　第三部分：促炎因子刺激膠質(zhì)瘤細(xì)胞中線粒體的質(zhì)量控制
　　1.使用LC3B標(biāo)記細(xì)胞自噬，使用WB和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)在LPS和IFN-γ聯(lián)合刺激下U87-MG中自噬水平的變化。
　　2.使用GFP-LC3進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的自噬體，檢測(cè)在LPS和IFN-γ聯(lián)合刺激下U87-MG中自噬水平的變化。
　　3.使用LC3B和MitoTracker進(jìn)行特異性熒光共定位，檢

9、測(cè)自噬體與線粒體的共定位情況。
　　4.使用LAMP1標(biāo)記溶酶體，MitoTracker標(biāo)記線粒體，檢測(cè)溶酶體和線粒體的共定位情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的增加，Iba1陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞的胞體增大，突起回縮，表現(xiàn)出明顯活化狀態(tài)；
　　2.隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的增加，IL-6的表達(dá)也隨之增加；
　　3.用LPS和IFN-γ聯(lián)合刺激U87-MG后，1）4h組和8h組線粒體明顯發(fā)生斷裂，由管狀變成球狀

10、或短棒狀；2）ROS的表達(dá)量增強(qiáng)，未發(fā)現(xiàn)明顯的線粒體膜脂質(zhì)過(guò)氧化；3）線粒體膜電位明顯下降；
　　4. LPS和IFN-γ聯(lián)合刺激后，用NAC抑制U87-MG中ROS的產(chǎn)生，具有球形形態(tài)線粒體的細(xì)胞比例明顯減少；
　　5. LC3B細(xì)胞免疫熒光和WB結(jié)果以及GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)果均顯示：LPS和IFN-γ聯(lián)合刺激后，U87-MG中自噬水平顯著提高；
　　6. LPS和IFN-γ聯(lián)合刺激未引起U87-MG中線粒體與自