聯(lián)合檢測外周血AFPmRNA和GPC3mRNA在大鼠肝癌微轉(zhuǎn)移中的意義.pdf

1、目的：隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來，具有高敏感性的RT-PCR已經(jīng)被用于實(shí)體瘤微轉(zhuǎn)移的檢測。甲胎蛋白和白蛋白mRNA是肝細(xì)胞癌微轉(zhuǎn)移檢測常見的標(biāo)志物，但是正常肝細(xì)胞也可表達(dá)甲胎蛋白和白蛋白mRNA，故對于其在微轉(zhuǎn)移檢測中的意義存在爭議。另外，由于腫瘤細(xì)胞存在基因異質(zhì)性，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的基因表達(dá)可能不一致，因此單標(biāo)志物檢測微轉(zhuǎn)移容易出現(xiàn)假陰性。GPC3是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有肝癌細(xì)胞特異性的基因，在肝癌組織中表達(dá)率顯著升高，在非癌組織及

2、癌旁組織均不表達(dá)，在非肝癌組織基本無表達(dá)，該特性使其有可能成為一種新的理想的肝癌分子標(biāo)記物。鑒于以上肝細(xì)胞癌微轉(zhuǎn)移檢測中存在的問題，以及GPC3的優(yōu)越性，我們推測：采用GPC3和AFP多標(biāo)志物聯(lián)合檢測可能有助于提高微轉(zhuǎn)移檢測的敏感性和特異性。 本研究在大鼠肝細(xì)胞癌模型中，通過聯(lián)合檢測外周血GPC3mRNA、AFPmRNA，以評價(jià)多標(biāo)志物聯(lián)合檢測微轉(zhuǎn)移的可行性，及AFPmRNA和GPC3mRNA在大鼠肝癌自然病程中的變化與腫瘤微轉(zhuǎn)

3、移的關(guān)系。為臨床肝癌的早期檢測奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：研究對象分為實(shí)驗(yàn)組和正常對照組：采用二乙基亞硝胺建立大鼠肝癌模型，清潔級雄性Wistar大鼠120只，體重150±20g，實(shí)驗(yàn)組102只、對照組18只。經(jīng)口咽插管灌喂2‰二乙基亞硝胺溶液[1]，每天0.9ml，每周連續(xù)灌喂5d；第13周始每周連續(xù)灌喂3d，至第18周停止給藥。對照組以等量生理鹽水灌喂。從第10周開始在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)宰殺大鼠，采用斷頸放血，完整采集外周血10ml并肝素

4、抗凝。按單個(gè)結(jié)節(jié)肝癌；2-5個(gè)結(jié)節(jié)肝癌；大于5個(gè)結(jié)節(jié)肝癌；有明顯其它器官轉(zhuǎn)移灶的肝癌對大鼠進(jìn)行分組，對照組為正常大鼠。提取外周血總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后，用巢式PCR檢測GPC3mRNA和AFPmRNA在外周血中表達(dá)，分析二者表達(dá)與微轉(zhuǎn)移發(fā)生的關(guān)系。 結(jié)果：1.肝癌模型的建立經(jīng)0.2％二乙基亞硝胺誘導(dǎo)后獲得75例成功構(gòu)建的肝癌大鼠，誘癌率73.53％，其中25例單個(gè)結(jié)節(jié)肝癌；20例2-5個(gè)結(jié)節(jié)肝癌；18例大于5個(gè)結(jié)節(jié)肝癌；12例其它

5、器官有明顯轉(zhuǎn)移灶的肝癌。 2.外周血總RNA的質(zhì)量檢測取總RNA約5ug進(jìn)行變性凝膠電泳后出現(xiàn)28s，18s，5s三條帶，其中28s約為18s的兩倍亮度，表明RNA質(zhì)量較好，適合用于巢式RT-PCR。 3.外周血微轉(zhuǎn)移的檢測3.1AFPmRNA、GPC3mRNA檢測75例成功構(gòu)建的肝癌大鼠中，其中25例單個(gè)結(jié)節(jié)肝癌中GPC3mRNA陽性率為32％，AFPmRNA陽性率為28％；20例2-5個(gè)結(jié)節(jié)肝癌中GPC3mRNA陽性

6、率為45％，AFPmRNA陽性率為35％；18例大于5個(gè)結(jié)節(jié)肝癌中GPC3mRNA陽性率為72.2％，AFPmRNA陽性率為61.1％；12例其它器官有明顯轉(zhuǎn)移灶的肝癌中GPC3mRNA陽性率為83.3％，AFPmRNA陽性率為75％；18例正常大鼠中未檢測到GPC3，而AFP陽性率為11.1％。 3.2雙標(biāo)志物聯(lián)合檢測與微轉(zhuǎn)移關(guān)系隨著腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性增大，GPC3mRNA、AFPmRNA的陽性率均明顯增高(p＜0.05)，

7、表明可以作為微轉(zhuǎn)移檢測標(biāo)志。同時(shí)GPC3mRNA、AFPmRNA的聯(lián)合檢測陽性率高于單一檢測的陽性率(p＜0.05)，表明二者的同時(shí)檢測可明顯提高陽性率；18例正常大鼠中未檢測到GPC3，AFP陽性率為11.1％，GPC3具有較高的敏感性和特異性。 結(jié)論1.實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)二乙基亞硝胺誘導(dǎo)后獲得75例成功構(gòu)建的肝癌大鼠，誘癌率73.53％(75/102)，死亡率7.84％(8/102)，模型誘導(dǎo)比較成功。 2.以AFPmRN