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1、目的: 手術(shù)切除、肝移植是目前治療原發(fā)性肝癌的主要手段,術(shù)后仍有約70%的患者存在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,原因是手術(shù)前即存在未檢出的微轉(zhuǎn)移灶,而微轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期處于免疫抑制未被發(fā)現(xiàn)。因此,早期發(fā)現(xiàn)外周血的肝癌細(xì)胞不僅對(duì)判斷肝癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)具有重要價(jià)值,而且對(duì)指導(dǎo)臨床治療亦有重要意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,近年來(lái),具有高敏感性RT-PC已經(jīng)被用于實(shí)體瘤微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)。甲胎蛋白是肝細(xì)胞癌微轉(zhuǎn)移檢測(cè)常見的標(biāo)志物,但是其敏感性只有39%-64
2、%,特異性為76%-91%,而且正常肝細(xì)胞、肝炎和肝硬化等非肝細(xì)胞癌患者外周血中也可能檢出甲胎蛋白,故對(duì)于其在微轉(zhuǎn)移檢測(cè)中的意義存在爭(zhēng)議。另外,由于腫瘤細(xì)胞存在基因異質(zhì)性,原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的基因表達(dá)可能不一致,因此單標(biāo)志物檢測(cè)肝細(xì)胞癌微轉(zhuǎn)移容易出現(xiàn)假陰性。GPC3是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種具有肝癌細(xì)胞特異性的基因,在肝癌組織中表達(dá)率顯著升高,在非癌組織及癌旁組織均不表達(dá),在非肝癌組織基本無(wú)表達(dá),是目前發(fā)現(xiàn)的在AFP陰性肝癌中表達(dá)率最高的基因。該特
3、性使其有可能成為一種新的理想的肝癌分子標(biāo)記物。鑒于以上肝細(xì)胞癌微轉(zhuǎn)移檢測(cè)中存在的問題,我們推測(cè):采用AFP和GPC3多標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)可能有助于提高微轉(zhuǎn)移檢測(cè)的敏感性和特異性。 本研究在圍手術(shù)期聯(lián)合檢測(cè)了肝細(xì)胞癌患者外周血中AFPmRNA和GPC3mRNA,以評(píng)價(jià)多標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)肝細(xì)胞癌微轉(zhuǎn)移的可行性和早期發(fā)現(xiàn)肝癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的價(jià)值。 方法: 研究對(duì)象分為四組病例及健康志愿者:A組:39例,組織學(xué)證實(shí)為肝細(xì)
4、胞癌;B組:19例,組織學(xué)證實(shí)為肝炎和肝硬化;C組:10例,組織學(xué)證實(shí)為肝血管瘤;D組:10例,組織學(xué)證實(shí)為轉(zhuǎn)移性肝癌;E組;19例,為健康志愿者。運(yùn)用巢式RT-PCR技術(shù)分別于術(shù)前、術(shù)后7天檢測(cè)各組外周血中AFPmRNA和GPC3mRNA的表達(dá),并隨訪19例行肝癌根治性切除的患者3-10個(gè)月。 結(jié)果: 1.術(shù)前外周血微轉(zhuǎn)移檢測(cè) 39例肝癌患者術(shù)前外周血標(biāo)本中,AFPmRNA、GPC3mRNA的檢出率分別為53.
5、8%(21/39)、61.3%(24/39)。AFPmRNA及GPC3mRNA的檢出率和TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移臨床參數(shù)密切相關(guān)。另外,當(dāng)肝癌直徑大于5cm、多結(jié)節(jié)、伴門靜脈癌栓,AFPmRNA及GPC3mRNA的檢出率明顯提高。而血漿甲胎蛋白水平、肝癌分化程度等與AFPmRNA及GPC3mRNA的檢出率無(wú)顯著相關(guān)。對(duì)照組中,B組AFPmRNA的檢出一率為10.5%(2/19)而GPC3mRNA未檢出;其余C、D、E組均未檢出AFPmRNA
6、和GPC3mRNA。此外,76.9%(30/39)的患者至少表達(dá)一種標(biāo)志物,38.5%(15/39)的患者兩種標(biāo)志物均陽(yáng)性。AFPmRNA和GPC3mRNA的檢出顯著相關(guān)(P<0.05),相關(guān)系數(shù)為0.214。 2.術(shù)后微轉(zhuǎn)移的檢測(cè) 在行根治性外科治療的19例肝癌患者中,7例(36.8%)術(shù)前檢出AFPmRNA,其中4例術(shù)后7天復(fù)查仍持續(xù)陽(yáng)性(A1組);3例患者術(shù)后7天檢測(cè)呈陰性(B1組);其余12例患者術(shù)前和術(shù)后檢測(cè)均
7、呈陰性(C1組)。在術(shù)后最長(zhǎng)10個(gè)月的隨訪期間,轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的病例是A1組2例(2/4)、B1組2例(2/3)、C1組5例(5/12)。術(shù)前外周血AFPmRNA的檢出和術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。 在行根治性外科治療的19例肝癌患者中,10例(52.6%)術(shù)前檢出GPC3mRNA,其中5例術(shù)后7天復(fù)查仍持續(xù)陽(yáng)性(A2組);5例患者術(shù)后7天檢測(cè)呈陰性(B2組);其余9例圍手術(shù)期檢測(cè)均為陰性(C2組)。在術(shù)后最長(zhǎng)10個(gè)月的
8、隨訪期間,轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的病例是A2組3例(3/5)、B2組2例(2/5)、C2組4例(4/9)。術(shù)前GPC3mRNA的檢出和術(shù)后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。 在19例隨訪的肝細(xì)胞癌患者中,以術(shù)后7天檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),GPC3的檢出率為21.6%(6/19);AFPmRNA的檢出率為26.3%(5/19)。3例患者AFPmRNA和GPC3mRNA雙陽(yáng)性(Ⅰ組);5例患者檢出一種標(biāo)志物(Ⅱ組);11例患者兩種標(biāo)志物均未檢出(Ⅲ
9、組)。在Ⅰ組中,3例患者在術(shù)后6月內(nèi)全部復(fù)發(fā);在Ⅱ組中,4例患者在術(shù)后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)(80%);Ⅲ組中,2例患者在隨訪期間復(fù)發(fā)(18.2%)。Ⅰ、Ⅱ組的復(fù)發(fā)率與Ⅲ組有顯著差異(P=0.016/2),表明術(shù)后外周血AFPmRNA和GPC3mRNA的檢出和術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有顯著相關(guān)性(P<0.05)。 結(jié)論: 1.以AFPmRNA或GPC3mRNA為標(biāo)志物,通過(guò)巢式逆轉(zhuǎn)錄PCR來(lái)檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者外周血微轉(zhuǎn)移是可行的。聯(lián)合檢測(cè)
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