轉錄因子C-EBPα在原發(fā)性腎小球疾病中的研究.pdf

1、終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)是各種慢性腎臟病(chronic kidneydisease,CKD)進展的最終結果。在歐美等發(fā)達國家,ESRD患者數(shù)目以每年5％-8％的速度迅速增長。美國腎臟數(shù)據(jù)登記系統(tǒng)(United States Renal Data System,USRDS)報告預計2015年美國ESRD發(fā)病和患病人數(shù)分別將高達13.6萬人/年和71.2萬人,與2000年相比分別上升了44％和

2、85％。國外普通人群中CKD患病率10％-16％,我國社區(qū)流調(diào)CKD患病率約9％-12％,上海瑞金醫(yī)院腎臟科2006年開展CKD發(fā)病率調(diào)查顯示在上海城市社區(qū)人群中CKD患病率為11.8％,但知曉率僅8.2％。由于CKD起病隱匿,早期易忽視,約50％為中青年及兒童患者,社會危害性極大。同時ESRD患者透析治療費用昂貴,消耗了巨大的社會衛(wèi)生資源。因此,CKD己成為重要的全球公共衛(wèi)生問題。
　　CKD的發(fā)病原因眾多,不同病因導致慢性腎功

3、能衰竭的進展速率不同。即使是相同的原發(fā)病,如IgA腎病(IgA nephropathy,IgAN),膜性腎病(membranousnephropathy,MN),其中部分患者可快速進展至ESRD,而另一部分患者病情可能相對穩(wěn)定。因此,如能篩選出疾病進展迅速的高?；颊?并給予積極治療,預防疾病進展到ESRD,有著更為重要的現(xiàn)實意義。目前臨床工作中常用病理表現(xiàn)、血壓、蛋白尿和血肌酐等指標判斷疾病的預后,但這些指標敏感性和特異性遠不能令人滿意

4、。所以,應用現(xiàn)代系統(tǒng)生物學技術,篩選CKD患者血液和尿液相關標志蛋白以及和疾病進展相關的標志物,對疾病早期診斷、早期治療乃至研究CKD病理生理機制具有重要價值。
　　本研究利用蛋白指紋圖譜技術對不同病理分型CKD患者進行血液和尿液相關蛋白標記分析,篩選出有意義的生物學標記蛋白,并在臨床患者中進行驗證,為CKD提供非創(chuàng)傷性診斷平臺。研究第一部分利用已成功建立的蛋白質(zhì)組學技術平臺,通過iTRAQ-2D-nano-HPLC-MS/MS技

5、術對原發(fā)性腎小球腎炎患者血清及尿液蛋白進行標記鑒定。通過ProteinPilot軟件分析,質(zhì)譜分析鑒定質(zhì)譜峰(spectra)1956個.篩選差異明顯蛋白97個,通過生物信息學技術,對篩選的蛋白修飾位點、亞細胞定位、功能分類以及蛋白交互調(diào)控網(wǎng)絡進行分析處理后,篩選出靶標蛋白之一C/EBPα(CAAT/enhancer binding proteins,C/EBP)。發(fā)現(xiàn)原發(fā)性腎小球腎炎患者血清中C/EBPα水平較正常對照組下降,而尿液中

6、C/EBPα水平較正常對照組上升,應用ELISA方法發(fā)現(xiàn)尿液中C/EBPα水平具有疾病差異性(MN組和IgAN組有統(tǒng)計學差異,P＜0.05)。通過免疫組化方法發(fā)現(xiàn),原發(fā)性腎小球腎炎患者腎臟組織存在C/EBPα表達由胞核向胞漿轉位的現(xiàn)象。上述結果提示C/EBPα可能可作為判斷慢性腎臟病或腎臟炎癥損傷的一個生物標志蛋白,并應用于指導臨床的診斷和治療。
　　本研究第二部分利用大鼠阿霉素腎病模型模擬人類腎小球疾病,檢測病理情況下腎臟組織、

7、血清和尿液C/EBPα的變化趨勢。其變化趨勢與原發(fā)性腎小球疾病時C/EBPα在血清和尿液中相似,再次驗證了第一部分蛋白組學的結果。同時,根據(jù)C/EBP家族特性,推測C/EBPα蛋白與PPARγ在腎臟疾病進展中可能存在串話作用,應用蛋白印跡法檢測病理情況下C/EBPα蛋白與PPARγ變化的趨勢的相關性,提示C/EBPα與腎臟纖維化的發(fā)生或腎臟疾病的進展密切相關。
　　本研究第三部分以腫瘤壞死因子(tumor necrosis fac

8、tor-alpha,TNF-a)及白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)為刺激劑,以人近端腎小管上皮細胞系(HK-2細胞)為研究對象,通過轉染野生型C/EBPα質(zhì)粒進一步觀察炎癥反應狀態(tài)下C/EBPα蛋白、PPARγ與單核細胞趨化因子(Monocyte chemotactic protein,MCP-1)及白介素-6(Interleukin-6,IL-6)表達的變化特點,發(fā)現(xiàn)轉染pEGFP-N1-CEBPα質(zhì)粒的細胞在

9、相同炎癥因子刺激下,分泌的相關趨化因子明顯減少,表明細胞高表達C/EBPα可提高細胞的抗炎能力。同時,轉染pEGFP-N1-CEBPα質(zhì)粒的細胞PPARγ的表達量明顯升高,在炎癥狀態(tài)下早期下降,后期有所增高,和相關趨化因子分泌的時間相匹配。這提示轉染pEGFP-N1-CEBPα質(zhì)粒的細胞可通過上調(diào)PPARγ在細胞核內(nèi)的表達量達到其抗炎作用的。因此,上調(diào)細胞中的C/EBPα蛋白可作為抗炎治療的靶點。
　　綜上,本研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性腎小球