雞脂肪分化轉錄因子PPARγ和C-EBPα抗體制備及功能研究.pdf

1、脂肪細胞分化是由分化轉錄因子調控的復雜過程。過氧化物酶體增殖物激活受體家族(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)和CCAAT增強子結合蛋白家族(CCAAT/enhance binding proteins，C/EBPs)等轉錄因子在脂肪細胞的分化過程中發(fā)揮著重要的功能。為了探討PPARγ和C/EBPa基因及其產物對肉雞腹脂含量的影響，本研究采用主動免疫策略，制備了雞PPAR

2、γ和C/EBPa的抗血清；通過PPARγ和C/EBPa重組蛋白主動免疫，觀察其對肉雞腹脂含量的影響。結果表明，通過主動免疫策略，獲得了較高滴度的抗血清；PPARγ主動免疫能顯著降低肉雞腹脂含量。主要包括以下幾部分研究內容： 1.PPARγ基因和C/EBPa基因原核、真核表達載體的構建根據雞PPARγ基因和C/EBPa基因cDNA序列設計一對引物，采用RT-PCR的方法擴增雞PPARγ基因和C/EBPa基因的cDNA片段并將其分別

3、插入到原核表達載體pGEX-4T-1和真核表達載體pcDNA3中；構建了PPARγ基因和C/EBPa基因的原核和真核表達載體pGEX-4T-1/PPARγ、pcDNA3/PPARγ、pGEX-4T-1/C/EBPa、pcDNA3/C/EBPa。 2.PPARγ基因和C/EBPa基因抗血清的制備為進一步研究PPARγ基因和C/EBPα基因的功能，將構建好的重組質粒pcDNA3-PPARγ和pcDNA3-C/EBPα，免疫小鼠，EL

4、ISA和Western blot結果表明pcDNA3-PPARγ和pcDNA3-C/EBPα免疫小鼠產生了效價較高和特異性較強的抗體。本研究所構建的真核表達載體pcDNA3-PPAR γ和pcDNA3-C/EBPα為在細胞水平上研究雞PPAR γ基因和C/EBPα基因超表達提供了有力的工具。 3.PPARγ和C/EBPa融合蛋白對肉雞腹脂含量的影響利用IPTG誘導含有原核表達質粒pGEX-4T-1/PPARγ和pGEX-4T-1

5、/C/EBPa的大腸桿菌BL21(DE3)菌株，表達GST-PPARγ和GST-C/EBPa融合蛋白，表達產物用Glutathione Sepharose 4B純化，將純化后的重組蛋白免疫肉仔雞，檢測其產生抗體情況及其對肉雞腹脂含量的影響。結果顯示融合蛋白GST-PPARγ在大腸桿菌胞內主要以包涵體的形式表達，分子量大約80 kDa；融合蛋白GST-C/EBPa在大腸桿菌胞內主要以可溶性蛋白形式表達，分子量大約62 kDa。主動免疫肉雞