轉(zhuǎn)錄因子PPARγ、C-EBPα在人骨髓間質(zhì)干細胞成骨成脂肪誘導分化中的作用研究.pdf

1、近年來的研究結(jié)果顯示，骨髓中的脂肪細胞含量增加與骨質(zhì)疏松等骨科疾病的發(fā)生有密切關(guān)系，并認為除了成骨與破骨的關(guān)系以外，骨髓中的脂肪細胞與成骨細胞的平衡在骨質(zhì)疏松等的發(fā)生中同樣具有重要作用。骨髓中的脂肪細胞與成骨細胞都來自骨髓中的間質(zhì)干細胞。骨髓間質(zhì)干細胞分化具有可塑性，其分化方向可以受到調(diào)控，并且分化成熟的成骨細胞或脂肪細胞都可以相互轉(zhuǎn)分化。骨髓間質(zhì)干細胞成骨成脂肪分化方向的調(diào)控的改變，可能是骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要原因。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)眾多傳統(tǒng)用于治

2、療骨質(zhì)疏松的藥物，比如Alendronate，對MSC分化方向的調(diào)控有很大作用。目前對于成骨成脂肪分化方向的調(diào)控主要集中在分化成脂肪的抑制上。關(guān)于間質(zhì)干細胞分化成脂肪的信號通路和轉(zhuǎn)錄因子的研究，將為臨床治療骨質(zhì)疏松等骨代謝疾病提供良好的基礎(chǔ)。
　　 關(guān)于成脂肪分化的轉(zhuǎn)錄因子的研究，就認為PPARγ和C/EBPα轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控成脂肪分化最重要的兩個因子。轉(zhuǎn)基因鼠和眾多細胞系的研究成果，提示PPARγ和C/EBPα在成骨成脂肪分化方

3、向調(diào)控中發(fā)揮重要作用，尤其是PPARγ被認為是其中的關(guān)鍵因子。但是目前的一些研究就提示慎重考慮種屬問題，并且轉(zhuǎn)基因鼠和細胞系得到的結(jié)果也有相互矛盾之處。目前關(guān)于PPARγ在人成骨成脂肪中的作用的數(shù)據(jù)大多來自噻唑烷二酮類（TZD）降糖藥。各類TZD藥物對成骨成脂肪的作用不一。目前關(guān)于PPARγ和C/EBPα在人MSC分化成骨成脂肪中的作用目前研究的尚少，得到的結(jié)果也有相互矛盾之處。
　　 有鑒于此，本研究的主要內(nèi)容如下：
　

4、　 第一部分：體外分離培養(yǎng)擴增MSC，并建立成骨成脂肪誘導分化體系。
　　 第二部分：探討PPARγ在成骨成脂肪中的表達規(guī)律，并進一步通過慢病毒介導的RNA干擾來研究PPARγ在成骨成脂肪中的作用。
　　 第三部分：探討C/EBPα在成脂肪中的表達規(guī)律，并進一步通過慢病毒介導的RNA干擾來研究C/EBPα在成脂肪中的作用。
　　 第一部分成人骨髓間質(zhì)干細胞體外分離、培養(yǎng)、擴增及成骨成脂定向誘導分化體系的建立

5、r>　　 1、方法
　　 取成人骨髓，F(xiàn)icoll-Hypaque密度梯度離心法分離得到單個核細胞，用含10％FBS的L-DMEM培養(yǎng)液重懸，貼壁培養(yǎng)，三天后通過換液去除未貼壁細胞。以后每隔三天換液繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細胞。細胞接近融合之后，用0.25％的胰酶消化按照1:3的比例傳代。對體外培養(yǎng)的MSCs進行形態(tài)學的觀察，并通過定向誘導MSCs分化為成骨細胞和脂肪細胞來確認其多向分化潛能。
　　 成脂誘導分化：單層培養(yǎng)的MSC

6、長滿之后四天，加入含地塞米松、IBMX、牛胰島素、indomethacin和10％FCS的H-DMEM（脂肪誘導液）誘導3天，再用含牛胰島素和10％FCS的H-DMEM（脂肪保持液）處理1天，如此循環(huán)3次后，用脂肪保持液處理7天，每隔3-4天換液1次。用油紅O染色的方法來鑒定胞內(nèi)的脂滴，用半定量RT-PCR的方法來鑒定一些脂肪相關(guān)基因（包括LPL、αP2和PPARγ2）的表達。
　　 成骨誘導分化：單層培養(yǎng)的MSCs以5×103

7、/c㎡的密度接種，培養(yǎng)至細胞密度達到約60％～70％長滿，加入含β-甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松和10％FCS的L-DMEM（成骨誘導液）開始誘導，每3天換液一次，如此循環(huán)。誘導一周后用半定量RT-PCR的方法檢測成骨相關(guān)基因bone sialoprotein（BSP）、collagen typeⅠ（COLⅠ）和osteocalcin（OCN）的表達情況。誘導15天后用茜素紅染色的方法來鑒定鈣結(jié)節(jié)。
　　 2、結(jié)果
　　

8、 原代MSCs在貼壁后第12～15天左右可達80％～100％的融合度。其后用胰酶消化傳代，隨著傳代次數(shù)的增多，雜細胞得以迅速清除。MSC在體外有強大的增殖能力，在第5代可獲得約9×107個MSC，而到了第10代，則可獲得4-5×109個MSC。早期代數(shù)的細胞一般呈紡錘形的成纖維細胞的形態(tài)，隨著傳代次數(shù)增多形態(tài)逐漸變得扁平寬大。但是第4到第8代的細胞其成脂和成骨分化的能力沒有明顯區(qū)別。
　　 在誘導的第四天就可以見到脂滴形成，但

9、2～3個星期是MSC誘導分化為成熟脂肪細胞所需要的。MSC的成脂分化過程從形態(tài)的演變方面很好地模仿了體內(nèi)脂肪細胞的分化過程。MSC分化而來的脂肪細胞表達LPL、FABP4和PPARγ2等脂肪特異基因。
　　 在成骨誘導的第7天，顯微鏡下可以見到微小的鈣結(jié)節(jié)形成，誘導2～3星期后鈣結(jié)節(jié)才能充分形成。MSCs分化而來的成骨細胞表達BSP、OCN、COLⅠ等成骨相關(guān)的基因。
　　 3、結(jié)論
　　 MSC可以用淋巴細胞分

10、離的方法從骨髓分離得到。MSC具有強大的增殖能力，可在體外大量擴增。隨著傳代次數(shù)的增加和培養(yǎng)時間的延長，細胞變得寬大，但是仍保持良好的多向分化潛能。MSC分化得到的脂肪細胞和成骨細胞在形態(tài)和相關(guān)基因的表達上與體內(nèi)的脂肪細胞和成骨細胞類似，因此MSC是一個良好的研究成骨成脂肪分化的模型。
　　 第二部分轉(zhuǎn)錄因子PPARγ在成人骨髓間質(zhì)干細胞
　　 誘導分化成骨成脂肪中的作用
　　 1、方法
　　 MSC按4

11、×103/c㎡密度接種于6孔板，細胞達到完全融合四天后，加入胰島素、IBMX、indomethacin、地塞米松等誘導劑，分別在0、1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、16天收集裂解細胞，western blot方法檢測PPART兩種亞型的表達變化情況。
　　 通過加入不同組合的成脂肪誘導劑，以進一步了解PPARγ兩種亞型表達的機制，以及PPARγ1和PPARγ2兩種亞型在MSC誘導分化成脂肪中的作用。
　　 T

12、roglitazone和BADGE用以替代indomethacin，以進一步研究配體對PPARγ表達的作用。
　　 類似的，MSC按4×103/c㎡密度接種于6孔板，細胞達到60～70％融合后，加入成骨細胞誘導液（OS）（含10-7mol/L地塞米松，10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，50μg/mL vitamin C），分別在0、2、4、6、8、10、12、14天收集裂解細胞，western blot方法檢測PPARγ的表達變

13、化情況。
　　 利用基于慢病毒載體PLL3.7的shRNA干擾技術(shù)，進一步探討PPARγ在MSC誘導分化成骨成脂肪中的作用。對病毒轉(zhuǎn)染后的細胞進行成骨成脂肪誘導分化。通過定量PCR和western blot檢測判斷PPARγ干擾的有效性。通過油紅O染色和定量的方法，判斷PPARγ干擾對MSC誘導分化成脂肪中脂肪滴形成的影響；并通過定量PCR檢測成脂肪相關(guān)基因LPL、FABP4和GPDH，以進一步判斷PPARγ干擾對MSC成脂肪誘

14、導分化的影響。通過堿性磷酸酶染色和活性測定，判斷PPARγ干擾對MSC分化成骨早期的影響；通過茜素紅S染色和鈣定量，判斷PPARγ干擾對MSC分化成骨終末期鈣沉積的影響。
　　 2、結(jié)果
　　 PPARγ兩種亞型在未分化的MSC中并不表達，在加入成脂肪誘導劑之后第二天，就檢測到PPARγ1的表達，但是PPARγ2的表達則在脂肪誘導的第六天才檢測到。加入脂肪誘導維持液以后，PPARγ的表達不但沒有繼續(xù)增加，反而有所下降。P

15、PARγ的表達在脂肪誘導的第三個循環(huán)（第9-11天）達到最高，在脂肪誘導的最后維持階段PPARγ的表達下降。在整個脂肪誘導分化過程中，PPARγ1都是為主要表達方式。
　　 通過油紅O染色和定量，我們發(fā)現(xiàn)，不加Dex的各組幾乎沒有成脂肪的，而且細胞形態(tài)也還是保持梭形。而單獨加入Dex，就可以引起MSC分化成脂肪中的細胞形態(tài)改變，細胞形態(tài)從梭形變?yōu)閳A形，但是單獨Dex處理，并沒有明顯的脂肪滴形成。在加有Dex的基礎(chǔ)上，加indom

16、ethacin或和IBMX都能引起一定程度的脂肪滴形成，加indomethacin的脂肪滴形成更多，加有indomethacin和IBMX能得到最高的誘導效率。但是進一步添加insulin，我們發(fā)現(xiàn)并不能提高誘導率。
　　 Western blot檢測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單一誘導劑（包括Dex）都無法導致PPARγ的表達。加有Dex的基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)再加入insulin不能導致PPARγ的表達。加入indomethacin或IBMX之后

17、能導致PPARγ1的低表達，但未能檢測到PPARγ2的表達。值得注意的是，indomethacin比IBMX導致的PPARγ1的表達高。在同時加入indomethacin和IBMX的情況下，PPARγ1的表達明顯增高，并開始有PPARγ2的表達。在此基礎(chǔ)上進一步添加insulin對PPARγ1和PPARγ2的表達沒有明顯的影響。
　　 在去除indomethacin的實驗條件下，再添加Troglitazone或BADGE，能很明

18、顯的誘導分化成脂肪，但是與加入indomethacin組相比，誘導分化的效率要差一些。Western blot檢測就發(fā)現(xiàn)，加入Troglitazone或BADGE不但促進PPARγ1的表達，而且能促進PPARγ2的表達。
　　 在MSC成骨誘導分化兩天后，開始檢測到PPARγ1的表達，在MSC誘導分化成骨中PPARγ1的表達逐漸增強，在誘導分化的最后階段達到最高峰。但是與MSC誘導分化成脂肪相比，在整個MSC誘導分化成骨中PPA

19、Rγ1的表達都較低，而且在整個MSC誘導分化成骨中PPARγ2的表達始終沒有檢測到。
　　 在MSC誘導分化成骨中，單純地塞米松就能誘導PPARγ1的表達，并且維生素C和β-甘油磷酸鈉能進一步促進PPARγ1的表達。
　　 基于慢病毒載體PLL3.7，成功構(gòu)建了PPARγshRNA干擾載體，并通過定量PCR和western blot驗證了干擾序列的有效性。按照MOI=10的條件，成功的將病毒轉(zhuǎn)導入MSC中。對轉(zhuǎn)導病毒之后

20、的MSC進行成脂肪成骨誘導。油紅O染色和定量的結(jié)果顯示了脂肪滴形成受到明顯抑制；定量PCR檢測的結(jié)果，也顯示LPL、FABP4和GPDH等脂肪相關(guān)基因的表達受到抑制；通過western blot檢測，發(fā)現(xiàn)PPARγ干擾同時導致C/EBPα的表達下降。在成脂肪誘導條件下，PPARγ干擾導致堿性磷酸酶活性輕微下降，未能檢測到鈣形成的變化。在成骨誘導條件下，PPARγ干擾導致堿性磷酸酶活性輕微下降，同時發(fā)現(xiàn)鈣沉積受到一定的影響。同時誘導分化成

21、骨成脂肪的條件下，觀察到類似的現(xiàn)象。
　　 3、結(jié)論
　　 3.1 PPARγ1和PPARγ2兩種亞型在MSC分化成脂肪中都有表達，但以PPARγ1的表達為主。PPARγ1可能在MSC分化早期中起到重要作用，而PPARγ2是MSC誘導分化成熟的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。
　　 3.2 Insulin對MSC誘導分化成脂肪沒有明顯作用，這可能是骨髓中脂肪細胞的特性，提示了利用骨髓間質(zhì)干細胞研究骨髓中細胞分化的必要性。
　

22、　 3.3 PPARγ2的表達需要indomethacin等配體的存在，但是BADGE的結(jié)果提示可能有種屬差異的存在。
　　 3.4 PPARγ1在MSC誘導分化成骨中表達，Dex在其中可能發(fā)揮重要作用，但具體機制不明確。
　　 3.5 PPARγ干擾之后，MSC誘導分化成脂肪受到明顯抑制，但并沒有明顯促進MSC誘導分化成骨，反而對MSC誘導分化成骨有輕微的促進作用，提示在人MSC誘導分化方向的調(diào)控中，PPARγ可能不

23、是一個關(guān)鍵的因素。
　　 第三部分轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα在成人骨髓間質(zhì)干細胞
　　 誘導分化成脂肪中的作用
　　 1、方法
　　 MSC按4×103/c㎡密度接種于6孔板，細胞達到完全融合四天后，加入胰島素、IBMX、消炎痛、地塞米松等誘導劑，分別在0、1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、16天收集裂解細胞，western blot方法檢測C/EBPα表達變化情況。
　　 通過加入不同組合的

24、成脂肪誘導劑，以進一步了解C/EBPα表達的機制，以及C/EBPα在MSC誘導分化成脂肪中的作用。
　　 利用基于慢病毒載體PLL3.7的shRNA干擾技術(shù)，進一步探討C/EBPα在MSC誘導分化成脂肪中的作用。對病毒轉(zhuǎn)染后的細胞進行成脂肪誘導分化。通過定量PCR和western blot檢測C/EBPα干擾序列的有效性。通過油紅O染色和定量的方法，判斷C/EBPα干擾對MSC誘導分化成脂肪中脂肪滴形成的影響；并通過定量PCR檢

25、測成脂肪相關(guān)基因LPL、FABP4和GPDH，以進一步判斷C/EBPα干擾對MSC成脂肪誘導分化的影響。
　　 2、結(jié)果
　　 C/EBPα在未分化的.MSC中并不表達，在加入成脂肪誘導劑之后第三天，才檢測到C/EBPα的表達，而且，我們發(fā)現(xiàn)在加入脂肪誘導維持液以后，C/EBPα的表達不但沒有繼續(xù)增加，反而下降。C/EBPα的表達在脂肪誘導的第三個循環(huán)（第9-11天）達到最高，在脂肪誘導的最后維持階段C/EBPα的表達下

26、降。
　　 單一誘導劑都無法導致C/EBPα的表達。加有Dex的基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)再加入I nsulin仍不能導致C/EBPα的表達。加有Dex的基礎(chǔ)上，加入indomethacin能明顯導致C/EBPα的表達，盡管表達程度不高，但加入IBMX，并不能導致C/EBPα的明顯表達。只有同時加入indomethacin和IBMX的情況下，C/EBPα才能充分表達。但在此基礎(chǔ)上進一步添加insulin對C/EBPα的表達沒有很大的影響。

27、
　　 成功構(gòu)建了基于慢病毒的C/EBPαshRNA干擾，并通過定量PCR和westernblot驗證了干擾序列的有效性。按照MOI=10的條件，成功的將病毒轉(zhuǎn)導入MSC中。對轉(zhuǎn)導病毒之后的MSC進行成脂肪誘導。油紅O染色和定量的結(jié)果顯示了脂肪滴形成受到明顯抑制；定量PCR檢測的結(jié)果，也顯示LPL、FABP4和GPDH等脂肪相關(guān)基因的表達受到抑制；通過western blot檢測，發(fā)現(xiàn)C/EBPα干擾同時導致PPARγ2的表達下

28、降，但是對PPARγ1的表達沒有太大的影響。
　　 3、結(jié)論
　　 3.1 C/EBPα在MSC誘導分化的早期開始表達，但是在MSC誘導分化的晚期下降，提示C/EBPα可能在MSC分化的早期發(fā)揮作用。
　　 3.2 Insulin對C/EBPα的表達沒有明顯作用，這進一步提示骨髓中脂肪細胞的特殊性。
　　 3.3 C/EBPα的表達時間較PPARγ1晚，但是早于PPARγ2的表達。各誘導劑作用的結(jié)果也表明