馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)體系建立及發(fā)育相關(guān)蛋白質(zhì)的分析.pdf

1、蛋白質(zhì)組學(xué)研究在功能基因組時(shí)代發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。雙向電泳(2-DE)技術(shù)是其關(guān)鍵技術(shù)之一，具有重復(fù)性好、極敏感和分辨率高等特點(diǎn)。馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是世界上第四大糧食作物，對(duì)其塊莖的發(fā)生發(fā)育過(guò)程進(jìn)行研究，了解其塊莖發(fā)育的機(jī)理，將為馬鈴薯的栽培、育種和生產(chǎn)提供理論依據(jù)。馬鈴薯塊莖的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜而又有規(guī)律的過(guò)程，塊莖蛋白質(zhì)的數(shù)量、種類(lèi)、豐度等在不同發(fā)育階段存在著一定的差異，而這些差異蛋白質(zhì)又參與基因的表

2、達(dá)和塊莖某些重要性狀的調(diào)控。因此，對(duì)馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究有助于我們對(duì)塊莖生長(zhǎng)和發(fā)育機(jī)理的理解，也對(duì)馬鈴薯塊莖產(chǎn)量及品質(zhì)等性狀的提高具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。 深入研究塊莖蛋白質(zhì)在發(fā)育過(guò)程中的差異表達(dá)，首先需要建立起馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)的2-DE體系，而樣品的制備則是2-DE的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響2-DE的分辨率和重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)中，我們采用三氯乙酸/丙酮沉淀法，改良三氯乙酸/丙酮沉淀法，酚提取法和兩步沉淀四種方法提取馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)，進(jìn)行

3、2-DE分離，對(duì)四種方法提取樣品蛋白質(zhì)的獲得量、純度及2-DE蛋白質(zhì)圖譜分辨率進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：兩步沉淀法提取塊莖蛋白質(zhì)的獲得量和純度較其它三種提取方法高，2-DE蛋白質(zhì)圖譜較清晰、分辨率高。兩步沉淀法提取馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)及其2-DE電泳技術(shù)的建立，為研究馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)組學(xué)提供了技術(shù)支撐。 用兩步沉淀法提取馬鈴薯塊莖發(fā)育過(guò)程中四個(gè)階段的蛋白質(zhì)，即匍匐莖的誘導(dǎo)和發(fā)生，匍匐莖的伸長(zhǎng)，匍匐莖縱向生長(zhǎng)的停止和塊莖的發(fā)生及膨大階段，

4、并進(jìn)行雙向電泳分析。結(jié)果表明：馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)主要集中在分子量在15.5kD-87.2 kD范圍，等電點(diǎn)范圍在3.8-7.2區(qū)域內(nèi)。(107.8 kD，pI 4.9)、(37.7 kD，pI 7.3)、(42.8 kD，pI 6.2)、(21.3 kD，pI 8.9)、(37.7 kD，pI 6.0)、(33.8 kD，pI 7.2)、(23.7 kD，pI 5.1)和(77.3 kD，pI 6.4)八個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)只在第一發(fā)育階段特異表達(dá)

5、，在隨后的發(fā)育過(guò)程中不再出現(xiàn)：在匍匐莖的伸長(zhǎng)階段，新出現(xiàn)了十三個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中(25.2 kD，pI 8.6)、(26.3 kD，pI 7.7)和(30.4 kD，pI 6.1)三個(gè)點(diǎn)在隨后的發(fā)育過(guò)程又消失，另外三個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(51.3 kD，pI 5.8)、(51.6 kD，pI 6.7)和(50.9 kD，pI 4.2)的豐度在該階段明顯下調(diào)；在匍匐莖縱向生長(zhǎng)的停止階段，出現(xiàn)十個(gè)新蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中五個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(45.1 kD，pI 6.

6、8)、(45.3 kD，pI 4.8)、(44.3 kD，pI 6.1)、(44.7 kD，pI 5.2)和(42.9 kD，pI 7.3)只在該階段特異表達(dá)，在豐度明顯上調(diào)的十四個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)中， (22.7 kD，pI 8.8)在該發(fā)育階段的豐度表現(xiàn)為最高，在塊莖的發(fā)生及膨大階段該蛋白質(zhì)點(diǎn)的豐度又下調(diào)，另有十七個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的豐度明顯下調(diào)，其中變化最明顯的為(61.3 kD，pI 6.8)和(58.5 kD，pI 6.4)兩個(gè)點(diǎn)；在第四發(fā)育