Hras12V轉(zhuǎn)基因小鼠肝腫瘤代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合分析.pdf

1、目的：
　　探究ras癌基因誘發(fā)肝腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，在代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平上的變化特點(diǎn)，為研究肝腫瘤的發(fā)病機(jī)制及臨床診斷治療提供有益的線索。
　　方法：
　　1.將Hras12V轉(zhuǎn)基因小鼠肝腫瘤組織和正常小鼠肝組織切成1cm3小塊，用冰浴的生理鹽水沖洗，立即凍存進(jìn)液氮中用于后續(xù)氣相質(zhì)譜分析和總RNA提取實(shí)驗(yàn)。剩余的組織存放在10％福爾馬林液中，用于組織病理學(xué)鑒定，確認(rèn)是否可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.制備氣相色

2、譜-質(zhì)譜分析所需樣本，進(jìn)行GC-MS兩個(gè)衍生化步驟，混合后上機(jī)待測。隨后進(jìn)行GC-TOF-MS檢測;然后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用設(shè)備的分析數(shù)據(jù)分析，用LECO Corporation和LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫的色度TOF4.3X軟件用來區(qū)分出原始物質(zhì)，數(shù)據(jù)用基線過濾及基線校準(zhǔn)、峰值對(duì)齊、去卷積分析、峰值識(shí)別和峰值區(qū)域集成，將產(chǎn)生的物質(zhì)列表輸入Pirouette software（模式識(shí)別，華盛頓伍丁維爾）用于多變量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3、。將氣相液相色譜-質(zhì)譜列出的物質(zhì)數(shù)據(jù)表輸入MSEA作為代謝物列表，選擇小鼠通路庫，同時(shí)ORA算法選擇超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行代謝物富集分析。
　　3.檢測兩組肝組織樣本中不同基因mRNA的表達(dá)量。抽提待測樣本的總RNA，用TruSeq RNA LT樣本準(zhǔn)備試劑盒制備測序文庫，測序用Illumina HiSeq2000。對(duì)UCSC Mouse Reference Genome(http：//genome.ucsc.edu/)進(jìn)行閱讀比對(duì)用To

4、phatv1.3.2軟件。DAVID v6.7數(shù)據(jù)庫用于測序數(shù)據(jù)分析和KEGG富集分析。
　　4.實(shí)驗(yàn)室對(duì)部分代謝物用試劑盒進(jìn)行檢測，包括：NADPH、甘油三酯、膽固醇、丙酮酸、乳酸、膽汁酸、谷胱甘肽和活性氧。以上代謝物檢測方法嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行。所有待測樣本進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.肝癌當(dāng)中富含脂質(zhì)與大體表型一致，HCC的脂質(zhì)生物合成是顯著增強(qiáng)的;
　　2.糖酵解途徑和檸檬酸穿梭的增強(qiáng)提供了

5、充足的乙酰輔酶A;強(qiáng)化的磷酸戊糖途徑供應(yīng)非常多的NADPH;
　　3.脂質(zhì)從頭合成相關(guān)性關(guān)鍵性酶活性都上調(diào);與膽汁酸合成有關(guān)的重要酶的活性全下調(diào);
　　4.肝癌組織與正常肝組織相比較，NADPH、丙酮酸、甘油三酯、膽固醇以及谷胱甘肽含量顯著升高，乳酸含量顯著性下降，而活性氧維持在正常水平。
　　結(jié)論：
　　在ras癌基因誘導(dǎo)的肝癌中，脂質(zhì)代謝、糖酵解、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環(huán)、檸檬酸穿梭、膽汁酸合成和氧化還原穩(wěn)態(tài)