肺炎克雷伯菌VI型分泌系統(tǒng)的比較基因組學(xué)研究.pdf

1、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是院內(nèi)感染最重要的多重耐藥條件致病菌之一。11個(gè)不同來源的肺炎克雷伯菌基因組已被全測(cè)序，包括耐碳青霉烯類抗生素的、屬于ST11型中國流行克隆株的臨床菌株HS11286。近期發(fā)現(xiàn)的VI分泌系統(tǒng)（type VI secretion system，T6SS）是一種細(xì)胞接觸依賴性的多組件跨膜通道，在細(xì)菌致病機(jī)制及細(xì)菌間拮抗作用中扮演著重要角色。T6SS已被發(fā)現(xiàn)存在于銅綠假單胞菌和霍亂弧菌

2、等多個(gè)革蘭陰性細(xì)菌中；但是在肺炎克雷伯菌中鮮有研究。本論文推測(cè)T6SS與肺炎克雷伯菌的致病性、耐藥性、自然生存和傳播性等關(guān)鍵生物學(xué)特性相關(guān)，利用生物信息學(xué)方法對(duì)已測(cè)序肺炎克雷伯菌基因組的T6SS基因簇和分泌效應(yīng)物進(jìn)行了系統(tǒng)地識(shí)別和比較，以輔助實(shí)驗(yàn)研究來解析T6SS的生物學(xué)功能。
　　本文首先預(yù)測(cè)了肺炎克雷伯菌的T6SS基因簇。通過文獻(xiàn)挖掘和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，本文識(shí)別了498個(gè)細(xì)菌菌株中的906個(gè)T6SS基因簇?cái)?shù)據(jù)，主要包括：(i)經(jīng)

3、過對(duì)708篇PubMed收錄文獻(xiàn)的檢索和人工校驗(yàn)，收集的57個(gè)菌株中64個(gè)T6SS、92個(gè)T6SE和25個(gè)免疫蛋白及127個(gè)調(diào)控因子；(ii)基于T6SS保守組件氨基酸序列的高度相似性預(yù)測(cè)的T6SS。SecReT6根據(jù) T6SS核心組件的序列相似性和基因排布，將這些T6SS系統(tǒng)地分為3種類型:i，ii和iii。利用PostgreSQL關(guān)系型數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)，本文建立了開放數(shù)據(jù)庫SecReT6。SecReT6整合了多種異源數(shù)據(jù)，提供了基于W

4、eb的T6SS核心組件、T6SE和免疫蛋白、調(diào)控因子等功能和分類信息的瀏覽和查詢服務(wù)。SecReT6還提供了相似性搜索、基因簇比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析等在線工具。此外，基于不同類型T6SS核心組件的隱馬爾科夫模型特征譜，開發(fā)了T6SS基因簇識(shí)別工具T6SS-HMMER。利用T6SS-HMMER工具，本文在11個(gè)已全測(cè)序的肺炎克雷伯菌基因組中識(shí)別了26個(gè)T6SS。其中，在肺炎克雷伯菌HS11286中識(shí)別2個(gè)T6SS基因簇：編碼了12個(gè)T6SS

5、核心組件的T6SS-1(KPHS_22970..KPHS_23190)，及編碼9個(gè) T6SS組件的T6SS-2(KPHS_32450..KPHS_32770)。
　　其次，本文采用了三種方法來預(yù)測(cè)肺炎克雷伯菌T6SS分泌效應(yīng)物(T6SE)：(i) SecReT6收錄了和已知T6SE高序列相似性的蛋白；(ii)通過T6SS基因簇比較分析發(fā)現(xiàn)，插入T6SS保守組件基因中的可變區(qū)可能攜帶了新的T6SE和相鄰的免疫蛋白；(iii)基于已知

6、T6SE的多重序列特征，提出一個(gè)基于支持向量機(jī)分類器的算法來預(yù)測(cè)零散分布在基因組的新T6SE。本文在肺炎克雷伯菌HS11286中識(shí)別了 T6SS-1基因簇編碼的效應(yīng)蛋白 KPHS_23105和4個(gè)免疫蛋白KPHS_23060-KPHS_23090。
　　最后，本文將T6SS保守基因簇的識(shí)別工作擴(kuò)展到細(xì)菌III型和IV型等多組件分泌系統(tǒng)，以及原噬菌體、整合性接合元件、整合子、插入序列和基因組島等可移動(dòng)遺傳元件的識(shí)別。這些分泌系統(tǒng)和可

7、移動(dòng)遺傳元件常攜帶致病因子和獲得性耐藥基因，可視為病原細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)基因。針對(duì)細(xì)菌基因組序列中這些致病和耐藥相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因的準(zhǔn)確和快速識(shí)別需求，本文開發(fā)了基于高性能計(jì)算機(jī)群的在線預(yù)測(cè)服務(wù)STeP。STeP提供的VRprofile工具可在10分鐘內(nèi)完成肺炎克雷伯菌 HS11286的5.3Mb染色體序列的分析任務(wù)；對(duì)預(yù)測(cè)出來的T3SS/T4SS/T6SS/T7SS和可移動(dòng)遺傳元件，VRprofile還提供了對(duì)后臺(tái)數(shù)據(jù)庫MobilomeDB收錄

8、已知元件的可視化比較分析服務(wù)。STeP服務(wù)器還提供了對(duì)完全或部分測(cè)序細(xì)菌基因組快速注釋工具 CDSeasy，細(xì)菌保守基因簇識(shí)別工具CGCfinder，COG基因集的可視化共定位工具COGviewer。
　　總之，本論文以肺炎克雷伯菌為切入點(diǎn)，對(duì)已測(cè)序細(xì)菌基因組中T6SS及分泌效應(yīng)物的分布進(jìn)行了系統(tǒng)地考查。所構(gòu)建的T6SS開放系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫和T6SE識(shí)別工具，有助于實(shí)驗(yàn)研究肺炎克雷伯菌及其他重要的革蘭陰性病原細(xì)菌中T6SS與致病機(jī)制及細(xì)