肺炎克雷伯菌全基因組DNA芯片研制及基于LVPC分型方法研究.pdf

1、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP)為革蘭陰性桿菌，在自然環(huán)境中分布廣泛，主要存在于人和動物的呼吸道和腸道中。肺炎克雷伯菌是引起社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院內(nèi)感染的重要條件致病菌，引起的感染主要包括敗血癥、肺炎、泌尿道感染、腦脊膜炎。在革蘭陰性菌引起的感染中，肺炎克雷伯菌已成為僅次于大腸桿菌的主要致病菌。過去的20年，在我國臺灣以及日本、歐洲、北美和韓國等國家出現(xiàn)了社區(qū)獲得性肺炎克雷伯菌化膿性肝膿腫，常常并發(fā)腦膜炎和

2、眼內(nèi)炎。
　　 近年來分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展，極大地促進了人們在基因水平上認識肺炎克雷伯菌。本研究利用完成測序的肺炎克雷伯菌全基因組序列，研制肺炎克雷伯菌的全基因組DNA芯片，建立基于芯片的比較基因組學技術(shù)平臺;以及通過LVPC基因分型方法找出不同肺炎克雷伯菌株之間的差異;綜合分析研究肺炎克雷伯菌基因組多態(tài)性，為從基因水平上探討肺炎克雷伯菌的種群結(jié)構(gòu)和基因組微進化奠定基礎(chǔ)。
　　 肺炎克雷伯菌全基因組DNA芯片的研制<

3、br>　　 根據(jù)肺炎克雷伯菌NTUH-2044全基因組序列，挑選出5075條基因，PCR擴增各基因并純化產(chǎn)物，點樣制備芯片。設(shè)計了3個質(zhì)控雜交組合，采用雙色熒光雜交策略，對芯片質(zhì)量進行評價。據(jù)此成功研制了肺炎克雷伯菌全基因組DNA芯片，并建立了基于全基因組DNA芯片的肺炎克雷伯菌比較基因組學技術(shù)平臺。
　　 基于差異分布的大片段基因簇(LVPC)的肺炎克雷伯菌基因分型
　　 通過比較基因組學對四株完成全基因組測序的肺炎

4、克雷伯菌NTUH-K2044、MGH78578、HS11286、KCTC2242各自的基因集進行兩兩比對，如果滿足coverage＞80％并且identity＞80％則認為兩個基因同源，最終從獲取的非冗余基因集中，篩選得到44個差異分布的大片段基因簇（LVPC，基因簇至少包括10個連續(xù)的基因，這些大片段基因簇在不同菌株的基因組中呈現(xiàn)不同的分布）。從差異分布的大片段基因簇中挑選一個有代表性的靶基因，根據(jù)靶基因設(shè)計引物，對82株強毒血清型（

5、K1、K2、K5、K20、K54和K57）KP菌株進行PCR擴增，結(jié)果分別用“1”或“0”表示，其中“1”表示在該LVPC位點PCR擴增結(jié)果為陽性，“0”表示在該LVPC位點PCR擴增結(jié)果為陰性。根據(jù)獲得的二元LVPC數(shù)據(jù)通過Cluster和Treeview軟件進行聚類分析。82株KP菌株可分為30種LVPC型，聚類生成6個群，同一血清型的菌株聚類在一起，不同血清型的菌株分布在不同的大簇內(nèi)，表現(xiàn)出各菌株的遺傳多態(tài)性。基于 LVPC的分型