線粒體MEF2D氧化修飾水平變化在PD發(fā)病中的作用.pdf

1、帕金森?。≒D）是一種神經(jīng)退行性疾病，其主要臨床特征是嚴(yán)重影響患者的運動功能。隨著我國逐漸進(jìn)入老齡化時代，PD越來越受到家庭與社會的關(guān)注[1,2]。PD的主要病理學(xué)特點是中腦SNc區(qū)DA神經(jīng)元發(fā)生變性和死亡，導(dǎo)致多巴胺的釋放減少，但DA神經(jīng)元變性死亡的具體機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，約5％-10%的PD例明確是和遺傳因素相關(guān)的，這部分病例與特定的基因改變有關(guān)[3]，而大多數(shù)PD病例是散發(fā)的，其確切的發(fā)病原因還不明確。流行病學(xué)研究已經(jīng)證明特定

2、的環(huán)境因素暴露（如神經(jīng)毒劑）和PD的發(fā)病之間有確定的聯(lián)系[4]，表明部分神經(jīng)毒劑會導(dǎo)致或促進(jìn)PD發(fā)病?，F(xiàn)在有一個被廣泛認(rèn)同的觀點是：遺傳與環(huán)境因素共同作用于細(xì)胞，破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)并導(dǎo)致了氧化應(yīng)激，繼而造成了DA神經(jīng)元的死亡，這其中一個關(guān)鍵的靶點是線粒體。越來越多的實驗數(shù)據(jù)表明，家族遺傳性PD中一些基因的突變可能是通過影響線粒體功能而產(chǎn)生致病效果，同樣，一些毒劑也是通過這個途徑導(dǎo)致PD發(fā)病。但是目前對線粒體功能紊亂、氧化應(yīng)激級聯(lián)反應(yīng)、蛋白聚集

3、和誘發(fā)神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵分子及信號通路缺乏進(jìn)一步的了解，妨礙了PD的診斷治療，特別是早期發(fā)現(xiàn)疾病。神經(jīng)影像學(xué)、基因組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的方法在反映疾病的發(fā)展和變化上仍存在較多的限制和障礙[5]。在發(fā)病機(jī)制深入研究基礎(chǔ)上，探索一種可靠、敏感的PD生物學(xué)標(biāo)記物成為目前急需解決的關(guān)鍵問題。
　　肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（MEF2）最早在骨骼肌的相關(guān)研究中被發(fā)現(xiàn)，后來被證實在越來越多的方面發(fā)揮自己特有的作用。MEF2D已被證實與神經(jīng)元存活密切相關(guān)[6,

4、7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子MEF2D對于DA神經(jīng)元的存活起關(guān)鍵性作用[6]，不同的細(xì)胞應(yīng)激能夠通過相應(yīng)的信號通路調(diào)節(jié)MEF2D的功能，對神經(jīng)元的存活產(chǎn)生影響。MEF2D在DA神經(jīng)元線粒體中表達(dá)，并參與呼吸鏈復(fù)合體I活性的調(diào)節(jié)[7]。在線粒體中，MEF2D特異性調(diào)節(jié)線粒體NADH脫氫酶6（ND6）基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。ND6是唯一由線粒體輕鏈編碼的蛋白質(zhì)，在呼吸鏈復(fù)合體 I組裝過程中發(fā)揮著必不可少的作用；降低線粒體MEF2D表達(dá)水平會

5、明顯抑制呼吸鏈復(fù)合體I的功能，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)過氧化物水平升高，誘發(fā)神經(jīng)元死亡[8]，而大量表達(dá)線粒體靶向MEF2D時可以保護(hù)神經(jīng)毒素誘發(fā)的DA神經(jīng)元死亡?，F(xiàn)有研究結(jié)果提示：線粒體MEF2D對與線粒體功能具有重要調(diào)控作用，MEF2D與其氧化修飾水平對于把金森并的發(fā)病過程具有重要影響。
　　本研究采用小鼠MPTP-PD亞急性模型，探索在PD模型中，DA神經(jīng)元線粒體MEF2D表達(dá)水平以及氧化修飾水平的動態(tài)變化；研究MEF2D、ND6以及線粒

6、體功能變化與DA神經(jīng)元損傷的關(guān)系；通過與其他轉(zhuǎn)錄因子對比，初步分析線粒體MEF2D及其氧化修飾水平作為PD生物學(xué)標(biāo)記物的可行性。
　　實驗一：MPTP-PD模型中動態(tài)檢測線粒體MEF2D水平變化
　　方法
　　（1）建立小鼠 MPTP-PD亞急性模型，實驗動物隨機(jī)分為4組：Con（對照）組，D1（給藥第1天）組，D3（給藥第3天）組，D5（給藥第5天）組，D1、D3和D5組為實驗組。實驗組小鼠按30mg/kg劑量腹腔注

7、射MPTP，注射時間為上午9點，每天一次，連續(xù)5天，對照組于同時間注射同等劑量0.9%生理鹽水。（2）在給藥的當(dāng)天下午3點處死D1組小鼠，第3天同時間點處死D3組小鼠，第5天同時間點處死 Con組和D5組小鼠，分別收取樣本。（3）使用免疫熒光染色法動態(tài)檢測小鼠中腦 DA神經(jīng)元水平變化情況。（4）分離細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及線粒體，使用免疫印跡法檢測分離純化效果。（5）使用免疫印跡法動態(tài)檢測小鼠中腦 DA神經(jīng)元細(xì)胞核和線粒體MEF2D水平變化情

8、況。（6）分離小鼠的小腦，皮層，紋狀體，使用免疫印跡法分別檢測各腦區(qū)線粒體MEF2D水平變化情況。
　　結(jié)果:
　?。?）免疫熒光結(jié)果顯示，在給藥的第1、3、5天中，與對照組相比，小鼠黑質(zhì)致密部 DA神經(jīng)元水平出現(xiàn)不同程度顯著下降，在給藥第5天幾乎消失殆盡，證明小鼠MPTP-PD亞急性模型建立成功。（2）免疫印跡結(jié)果顯示細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核以及線粒體分離效果良好，相互之間沒有混雜或污染，達(dá)到實驗要求。（3）在給藥的1、3、5天中，

9、細(xì)胞核MEF2D水平?jīng)]有出現(xiàn)明顯變化，而同區(qū)域的線粒體MEF2D在給藥的第一天即出現(xiàn)明顯下降（P<0.05），并在第3天和第5天出現(xiàn)顯著下降（P<0.01）。（4）小鼠小腦，皮層，紋狀體線粒體MEF2D水平在給藥的1、3、5天中沒有出現(xiàn)明顯變化，只有黑質(zhì)區(qū)線粒體MEF2D水平與對照組相比明顯降低（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　?。?）在PD模型中，小鼠黑質(zhì)區(qū)線粒體 MEF2D水平變化與同時間點中腦 DA神經(jīng)元損失水平相一致

10、，能夠較好地反映 DA神經(jīng)元水平變化情況。（2）小鼠黑質(zhì)區(qū)線粒體MEF2D水平變化并不是由非特異性應(yīng)激反應(yīng)所引起，其變化水平與DA神經(jīng)元受損程度密切相關(guān)。
　　實驗二：MPTP-PD模型中動態(tài)觀測核轉(zhuǎn)錄因子Nurr1和線粒體轉(zhuǎn)錄因子TFAM的水平變化
　　方法:
　?。?）同實驗一建立小鼠MPTP-PD亞急性模型，隨機(jī)分為4組：Con組，D1組，D3組，D5組。（2）使用免疫印跡法檢測小鼠中腦DA神經(jīng)元Nurr1和TF

11、AM動態(tài)水平變化。
　　結(jié)果:
　?。?）在PD模型中，小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子Nurr1在給藥的第1、3、5天中沒有出現(xiàn)明顯的變化，同區(qū)域線粒體轉(zhuǎn)錄因子TFAM在給藥的第1天和第3天沒有明顯變化，第5天時出現(xiàn)明顯下降（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　?。?）在PD模型中，細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子Nurr1和線粒體轉(zhuǎn)錄因子TFAM這兩種重要的存活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子對于多巴胺能神經(jīng)元的水平變化都不夠敏感，線粒體MEF2

12、D相比于Nurr1和TFAM，對于多巴胺能神經(jīng)元的損傷更加敏感，能夠更好地反映多巴胺能神經(jīng)元的受損程度。
　　實驗三：觀察線粒體MEF2D氧化修飾水平與DA神經(jīng)元線粒體功能變化的相關(guān)性
　　方法:
　　（1）同實驗一建立小鼠MPTP-PD亞急性模型，隨機(jī)分為4組：Con組，D1組，D3組，D5組。（2）使用OxyBlot技術(shù)檢測線粒體MEF2D氧化修飾水平動態(tài)變化。（3）使用qRT-PCR技術(shù)檢測ND6 mRNA水平的

13、動態(tài)變化。（4）通過測定在450nm下NADH的氧化速率檢測呼吸鏈復(fù)合體I活性的動態(tài)變化。
　　結(jié)果:
　?。?）在PD模型中，與對照組相比，中腦DA神經(jīng)元線粒體MEF2D氧化修飾水平自給藥第3天開始出現(xiàn)明顯升高，在給藥的1、3、5天中呈逐漸升高趨勢。（2）同區(qū)域 ND6 mRNA水平在給藥第3天明顯下降（P<0.05），在第5天顯著下降（P<0.01）。（3）同區(qū)域Complex I活性在第3天和第5天時出現(xiàn)顯著下降（P<