MEF2D在活化的小膠質(zhì)細胞內(nèi)的表達及作用.pdf

1、背景：
　　帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是全球第二大神經(jīng)退行性疾病，在60歲以上老人中，其發(fā)病率達到了1％，該病不僅嚴重影響了病人的身心健康，而且給家庭及社會都會造成巨大的負擔(dān)。PD表現(xiàn)為慢性進展病程，臨床表現(xiàn)多樣，其中靜止性震顫是PD的典型表現(xiàn)。PD的病理表現(xiàn)主要是中腦黑質(zhì)致密部（Substantia nigra pars compacta,SNc）多巴胺能神經(jīng)元缺失，從而引起紋狀體內(nèi)多巴胺含量顯著減

2、少，最終導(dǎo)致發(fā)病。
　　小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫固有細胞，其在監(jiān)視大腦內(nèi)損傷及病原體侵入方面發(fā)揮重要的免疫學(xué)作用，同時在維護神經(jīng)元微環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。小膠質(zhì)細胞在中腦SNc區(qū)密度明顯高于其他腦區(qū)，細胞動物實驗以及PD病人尸檢腦片均已證明了小膠質(zhì)細胞在PD發(fā)病過程中起了重要作用，因此小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)被認為是多巴胺能神經(jīng)元的丟失、PD發(fā)病的重要原因之一。
　　肌細胞增強因子(Myocyte e

3、nhancer factor,MEF2)作為機體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，其廣泛表達于各種細胞，如骨骼肌細胞、心肌細胞，免疫細胞及神經(jīng)元等，通過調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮重要的作用。近年來，不斷的研究表明，MEF2在PD病人中，對于多巴胺能神經(jīng)元的保護具有重要作用。此外，已有研究顯示在外周T細胞中可以檢測到MEF2D表達，并且MEF2D參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)過程。但是，對于MEF2D在小膠質(zhì)細胞中是否表達，以及其在小膠質(zhì)細胞中的主要作用的研究，目前國

4、內(nèi)外還沒有這方面的報道。
　　目的：
　　本實驗主要研究轉(zhuǎn)錄因子MEF2D在腦內(nèi)的小膠質(zhì)細胞內(nèi)的表達情況、MEF2D轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游靶基因，以及在小膠質(zhì)細胞活化時，MEF2D在炎癥反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用與相關(guān)機制及其對多巴胺能神經(jīng)元存活的影響。
　　方法：
　　首先，觀察活化的小膠質(zhì)細胞內(nèi)MEF2D的表達水平。通過腹腔注射MPTP，建立C57小鼠急性PD模型，制作SNc區(qū)腦組織切片，使用免疫熒光染色觀察小膠質(zhì)細胞內(nèi)的ME

5、F2D水平。使用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激BV2細胞系及原代培養(yǎng)的膠質(zhì)細胞，通過qPCR及免疫印跡檢測技術(shù)，觀察不同時間點下MEF2D的mRNA水平及蛋白水平表達情況，然后利用EMSA方法檢測MEF2D的活性變化。
　　其次，探索LPS刺激條件下BV2細胞系內(nèi)MEF2D的功能作用。通過qPCR及ELISA實驗方法檢測LPS刺激條件下BV2內(nèi)的炎癥因子TNF-α的表達水平及抗炎因子IL-10的表達水平

6、。通過ChIP技術(shù)檢測MEF2D與IL-10基因啟動子區(qū)結(jié)合的情況。利用含有能特異性干擾MEF2D的shRNA的重組慢病毒感染BV2，檢測LPS刺激BV2細胞條件下，細胞內(nèi)IL-10及TNF-α的表達情況。利用BV2細胞的培養(yǎng)上清建立小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元的共培養(yǎng)模型，通過MTT及TUNEL實驗檢測不同實驗條件下，共培養(yǎng)中的神經(jīng)元存活情況。
　　結(jié)果：
　　實驗一：中腦黑質(zhì)區(qū)活化的小膠質(zhì)細胞內(nèi)MEF2D的表達變化。
　　通

7、過建立急性PD模型，可以看到受到刺激后活化的小膠質(zhì)細胞內(nèi)MEF2D表達水平明顯升高，同時SNc區(qū)多巴胺能神經(jīng)元死亡增加。使用LPS刺激BV2細胞及原代培養(yǎng)的膠質(zhì)細胞，可以看到，在受到LPS刺激24小時后，原代細胞內(nèi)的MEF2D表達水平明顯升高，而在BV2細胞內(nèi)，LPS刺激18小時后MEF2D的mRNA水平及蛋白水平均開始升高。使用EMSA技術(shù)可以檢測到LPS刺激24小時后，BV2內(nèi)的MEF2D蛋白活性水平也是升高的。
　　實驗二：

8、活化的小膠質(zhì)細胞內(nèi)MEF2D調(diào)控的靶基因的研究。
　　檢測LPS刺激條件下，BV2的TNF-α及IL-10的表達，可以看到TNF-α表達水平在2小時達到最高，而IL-10的表達從刺激后18小時開始升高，且其升高趨勢和MEF2D的變化是相符合的。ChIP實驗顯示，IL-10是MEF2D調(diào)節(jié)的下游因子。使用慢病毒干擾BV2內(nèi)MEF2D的表達，免疫印跡實驗檢測干擾效率符合實驗要求。干擾MEF2D后，LPS刺激后BV2內(nèi)IL-10的表達水

9、平及分泌水平均顯著降低，而TNF-α的mRNA表達水平明顯升高。
　　實驗三：活化的小膠質(zhì)細胞內(nèi)MEF2D對于多巴胺能神經(jīng)元存活的影響
　　用培養(yǎng)BV2細胞的上清液培養(yǎng)多巴胺能神經(jīng)元細胞系SN4741細胞，建立共培養(yǎng)模型。干擾BV2細胞內(nèi)MEF2D的表達或者利用IL-10中和抗體阻斷IL-10的功能，均能夠提高LPS刺激后BV2細胞培養(yǎng)上清液的神經(jīng)元毒性，誘導(dǎo)更多的神經(jīng)元凋亡。
　　結(jié)論：
　　我們的研究首次揭示

10、了MEF2D在小膠質(zhì)細胞內(nèi)表達，其表達水平在小膠質(zhì)細胞活化后明顯升高，升高的MEF2D同時伴隨著神經(jīng)炎癥因子的表達降低及抗炎因子的表達升高，通過分子生物學(xué)及細胞生物學(xué)方法我們發(fā)現(xiàn)MEF2D直接調(diào)控了抗炎因子IL-10的表達。從而闡明了一個全新的小膠質(zhì)細胞活化后炎癥的發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)過程：小膠質(zhì)細胞活化引起了MEF2D水平的升高，MEF2D調(diào)節(jié)IL-10基因的轉(zhuǎn)錄過程，從而使其表達及分泌增多，升高的抑炎因子抑制了小膠質(zhì)細胞分泌炎性因子，明確