肌細胞增強因子MEF2D在結直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用和分子機制研究.pdf

1、全世界范圍內(nèi)結直腸癌都是最常見的惡性腫瘤之一，也是危及人類健康的重大疾病。近年來我國結直腸癌的發(fā)病率和死亡率逐漸上升，結直腸癌的防治問題日益重要。結直腸癌有高轉(zhuǎn)移的腫瘤生物學特性，臨床上轉(zhuǎn)移性結直腸癌患者占到腸癌總患者的40％以上，其預后極差，現(xiàn)有治療手段大多只能延長患者生存而無法治愈，所以結直腸癌的轉(zhuǎn)移是其防治中的重點和難點。但關于腸癌轉(zhuǎn)移的機制認識還很不足，沒有明確的轉(zhuǎn)移預測分子標志，也沒有很好的治療靶點，所以研究結直腸癌的轉(zhuǎn)移機制

2、有重大意義。
　　通常認為腫瘤細胞的上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移步驟中重要的一環(huán)，但腸癌EMT的過程中有些問題目前認識得還遠遠不夠。比如經(jīng)典的EMT轉(zhuǎn)錄因子在腸癌細胞中是如何被調(diào)控的，誘導腫瘤發(fā)生EMT的微環(huán)境信號又是通過哪些分子來激活癌細胞中的EMT關鍵基因的。對這些問題的探討有助于深入認識腸癌EMT的機制，從而為轉(zhuǎn)移性腸癌的防治發(fā)現(xiàn)潛在的分子靶點。

3、>　　MEF2(Myocyte Enhancer Factor2)家族是具有多種生物學功能的轉(zhuǎn)錄因子家族，其在胚胎發(fā)育，器官形成，肌肉，心血管和神經(jīng)系統(tǒng)中的重要作用已早被人們所認識。近年來MEF2家族成員在腫瘤的作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)。我們課題組之前發(fā)現(xiàn)MEF2家族第4號成員即MEF2D在肝癌中異常高表達，其促進肝癌細胞增殖并導致預后不良。后續(xù)有其他課題組報道了MEF2D在肺癌和骨肉瘤中的促癌作用，提示MEF2D可能是某些實體瘤中的潛在“癌基

4、因”，但MEF2D在結直腸癌中作用尚無報道，而且之前MEF2D在癌癥中的研究主要局限于其對癌細胞增殖的作用，MEF2D是否具有其他促腫瘤功能目前也不明確。
　　基于上述研究背景，我們在結直腸癌中展開了MEF2D促腫瘤功能的研究，致力于探討MEF2D對結直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其機制。
　　本課題的主要研究內(nèi)容及結果如下:
　　1.檢測臨床結直腸癌組織中MEF2D的表達情況，并探討MEF2D表達與腫瘤的臨床病理特征和患者預

5、后的關系
　　以免疫組化的方法在93例臨床結直腸癌標本中探討了MEF2D的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)MEF2D在結直腸癌組織中較相鄰癌旁組織和對應正常腸粘膜組織有顯著異常的高表達，提示MEF2D可能在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著某些作用。
　　通過比較不同臨床病理特征的患者腫瘤中MEF2D表達的差異，我們發(fā)現(xiàn)MEF2D的異常高表達與結直腸癌的淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移以及復發(fā)具有正相關性，而與患者的生存時間呈負相關，這些結果初步提示了MEF2

6、D可能促進腫瘤轉(zhuǎn)移，并導致不良預后。
　　2.在細胞實驗和動物腫瘤模型中研究了MEF2D對腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響
　　在高侵襲且間質(zhì)樣的癌細胞與低侵襲且上皮樣的癌細胞之間比較MEF2D的表達，我們發(fā)現(xiàn)MEF2D表達量與細胞的侵襲能力正相關，而與上皮樣標志物E-cadherin表達負相關。通過敲低MEF2D和過表達MEF2D，我們證明了MEF2D具有促進腸癌細胞遷移和侵襲轉(zhuǎn)移的功能，并在動物實驗中驗證了MEF2D對腸癌細胞

7、在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移的重要作用。
　　3.研究MEF2D對腸癌細胞EMT表型的影響
　　通過在MEF2D高表達的間質(zhì)樣腸癌細胞中敲低其表達，同時在低MEF2D表達的上皮樣腸癌細胞中過表達MEF2D，我們發(fā)現(xiàn)MEF2D對腫瘤細胞的EMT表型確有調(diào)控作用:它在間質(zhì)樣細胞中維持其間質(zhì)樣表型，并促進上皮樣細胞發(fā)生EMT。
　　4.發(fā)現(xiàn)MEF2D調(diào)控EMT的關鍵分子ZEB1，并探討其調(diào)控的具體分子機制
　　通過敲低MEF2D觀察

8、其對部分EMT關鍵分子表達的影響，結果發(fā)現(xiàn)多種細胞中ZEB1的表達均明顯下降。通過MEF2D過表達實驗，免疫熒光，流式細胞術等進一步檢測MEF2D與ZEB1的表達的關系，證明了EMT關鍵轉(zhuǎn)錄因子之一的ZEB1的表達受到MEF2D的調(diào)控。
　　通過染色質(zhì)免疫沉淀，啟動子報告基因檢測等方法實驗證明了ZEB1是MEF2D直接靶基因。另外我們發(fā)現(xiàn)敲低MEF2D后ZEB1啟動子組蛋白乙?；綔p低，組蛋白乙酰化酶p300在ZEB1啟動子上的

9、結合下降。
　　5.在微環(huán)境EMT誘導因子的誘導下觀察MEF2D的表達及其功能
　　以常用的腸癌細胞EMT誘導因子如EGF和缺氧，構建腸癌細胞的EMT模型，并觀察其中MEF2D的變化。實驗結果發(fā)現(xiàn)MEF2D在多種微環(huán)境EMT誘導信號刺激下表達都明顯且迅速地上調(diào)，敲低MEF2D后部分因子誘導的細胞EMT過程受到明顯的阻礙。
　　6.探討MEF2D在微環(huán)境EMT誘導因子激活ZEB1表達中的作用
　　通過觀察MEF2D

10、和ZEB1在胞外EMT信號刺激下表達的動態(tài)變化，我們推測MEF2D的表達上調(diào)可能是ZEB1表達激活的前提。在MEF2D穩(wěn)定敲低的細胞中以多種EMT誘導因子來刺激細胞，發(fā)現(xiàn)其ZEB1的表達激活被阻斷。并且我們在實驗小鼠轉(zhuǎn)移瘤標本中觀察到，在MEF2D敲低細胞接種產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移腫瘤中ZEB1的表達不能檢出。
　　綜上所述，本研究得出的主要結論有:
　　1.MEF2D在人類結直腸癌中異常高表達且與轉(zhuǎn)移和預后不良相關;
　　2.M