生防芽孢桿菌胞外蛋白酶的純化及其拮抗作用.pdf

1、芽孢桿菌(Bacillus spp．)是存在于土壤和植物微生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢微生物種群，具有很強的抗逆能力和抑菌防病作用，其抗菌防病機制主要包括競爭作用、拮抗作用和誘導植物抗病性等方面。其中芽孢桿菌產(chǎn)生的細胞壁降解酶類(如蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、β-1.3-葡聚糖酶等)是重要的拮抗物質(zhì)之一。有關(guān)該菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶(Chitinase)和β-1.3-葡聚糖酶(β-1.3-glucanase)在生防中的作用已有一些研究。在工業(yè)上，芽孢桿菌是生產(chǎn)蛋白

2、酶的主要菌株，國內(nèi)有關(guān)芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的報道很多，而未見顯示明顯生防活性的芽孢桿菌胞外蛋白酶及其拮抗作用的相關(guān)報道。 本文從作物根際土壤中篩選高產(chǎn)蛋白酶并對棉花枯萎病菌及多種植物病原真菌具有拮抗作用的生防芽孢桿菌，并對其產(chǎn)生的胞外蛋白酶在生防中的作用進行了研究，具體結(jié)果如下： 1.從山東泰安、青島小麥和花生根際土壤中分離到的118株細菌中通過透明圈實驗、平板抑菌實驗得到1株高產(chǎn)蛋白酶并且對棉花枯萎病菌(Fusariumo

3、xysporum f.sp.vasinfectum)及多種植物病原真菌具有拮抗作用的生防細菌T2。通過形態(tài)特征、生理生化及16S rDNA同源性序列分析，鑒定該菌為枯草芽孢桿菌(Bracillus subtilis)。 2.明膠原位電泳結(jié)果顯示：菌株T2在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)可產(chǎn)生多種蛋白酶。最佳產(chǎn)酶條件為37℃、60h。培養(yǎng)液經(jīng)硫酸銨分級沉淀(30％～50％)、DEAE Sepharose Fast Flow、SP Scp

4、harose Fast Flow離子交換層析、SephadexG-75分子篩層析分離純化到一種蛋白酶。經(jīng)SDS-PAGE電泳銀染后呈單帶，分子量約為29.0 kDa。 3.以酪蛋白為底物測定了溫度和pH對蛋白酶活性的影響。結(jié)果表明：酶作用的最適溫度為60℃，最適pH為8.0。在熱穩(wěn)定性方面，低于50℃時酶活性較穩(wěn)定，50℃保溫30 min，酶活性保持在80％以上。在pH穩(wěn)定性方面，以不同pH值4℃處理1h顯示，該蛋白酶在pH5.

5、0～7.5范圍內(nèi)較穩(wěn)定。為進一步鑒定蛋白酶的性質(zhì)，本研究測定了酶的底物特異性和金屬離子及修飾劑對酶活性的影響。結(jié)果表明：該蛋白酶對酪蛋白具有最高的活性，對偶氮酪蛋白具有較高的活性，但對于牛血清白蛋白和卵清蛋白則活性較低。Na+、K+、pb2+、EDTA對酶有激活作用，Ca2+、Ba2+、Al3+、Zn2+、Mn2+、Hg2+、SDS對酶有部分抑制作用，而PMSF可完全抑制酶活，因為PMSF是蛋白酶絲氨酸殘基的特異性抑制劑，推測該酶是一種

6、絲氨酸蛋白酶。 4.菌株T2蛋白粗提液抑菌實驗表明：經(jīng)硫酸銨沉淀后的蛋白粗提液Ⅰ及加熱(100℃，30min)后的蛋白粗提液Ⅱ均可抑制棉花枯萎病菌菌絲生長及孢子萌發(fā)，但后者的抑制作用減弱，表明在參與拮抗作用的胞外蛋白中，除了耐熱的抗菌蛋白類物質(zhì)，不耐熱的酶類等物質(zhì)發(fā)揮了重要作用。進一步研究純蛋白酶液對棉花枯萎病的拮抗作用發(fā)現(xiàn)，菌株T2所產(chǎn)生的胞外蛋白酶可使棉花枯萎病菌孢子萌發(fā)的芽管畸形、膨大、形成圓泡狀物，使棉花枯萎菌菌絲溶解并發(fā)生明顯