嚴(yán)重?zé)齻笕毖鹾挺履I上腺素能受體持續(xù)激活導(dǎo)致心肌損害的機制及心肌保護.pdf

1、嚴(yán)重?zé)齻笮墓δ懿蝗霈F(xiàn)較早,可誘發(fā)或加重休克,成為燒傷后多器官功能不全(MODS)的重要啟動因素之一[1]。在各種動物模型和人心臟中的大量研究表明不斷增加的心肌細胞凋亡是心功能不全的主要原因。燒傷后心肌局部血流量迅速減少,發(fā)生缺氧損害,缺氧損害本身即可導(dǎo)致心肌細胞的死亡。與此同時嚴(yán)重?zé)齻鸬某掷m(xù)應(yīng)激狀態(tài)使交感-腎上腺素髓質(zhì)興奮性增加,血液兒茶酚胺上升為正常的7～8倍[2],進而持續(xù)激活心肌細胞上的β腎上腺素能受體(β-AR),最終導(dǎo)

2、致心肌細胞凋亡或者壞死。因此缺氧和β。腎上腺素能受體過度激活可能是嚴(yán)重?zé)齻笮募〖毎劳龅膬纱髶p傷因素。
　　 熱休克蛋白90(HSP90)作為一種分子伴侶,其作用是維護大量蛋白折疊和構(gòu)象成熟。HSP90除了具有分子伴侶功能,還參與調(diào)節(jié)了多種細胞信號通路和細胞功能[3]。研究證明HSP90對多種凋亡誘導(dǎo)因子引起的心肌細胞凋亡具有保護作用。本實驗首先檢測了HSP90是否具有抗缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的作用。
　　 我們建立體

3、外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞缺氧模型,應(yīng)用HSP90的特異性抑制劑格爾德霉素(geldanamycin,GA)抑制心肌細胞HSP90活性。我們運用MTT法檢測心肌細胞活力,酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒檢測心肌細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)的漏出率、TUNEL,染色檢測心肌凋亡率等觀測多項細胞生物學(xué)指標(biāo)。結(jié)果顯示:缺氧引起心肌細胞膜結(jié)構(gòu)破壞、細胞活力下降,并最終導(dǎo)致細胞凋亡;用GA抑制HSP90活性后,心肌細胞活力下降和細胞凋亡明顯加劇。這

4、些結(jié)果明確了HSP90對心肌具有抗缺氧損傷的內(nèi)源性保護效應(yīng)。
　　 我們進一步探討了HSP90抗缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的作用機制。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(P13K/Akt)信號通路作為細胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài),在細胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡、促進增殖的關(guān)鍵作用。P13K/Akt信號通路能夠提高心肌功能和促進心肌細胞的存活。研究提示HSP90可能是蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)的

5、上游調(diào)節(jié)分子。所以我們假設(shè)HSP90對嚴(yán)重?zé)齻蟮男募〖毎谋Ｗo作用機制是通過調(diào)控P13K/Akt通路的抗凋亡作用。本實驗對這一假設(shè)進行了驗證。
　　 我們應(yīng)用Western Blot檢測心肌細胞缺氧損傷后HSP90蛋白表達規(guī)律,并運用GA抑制HSP90后檢測缺氧狀態(tài)下心肌細胞P13K/Akt通路中的多種效應(yīng)分子如Akt,Bcl-2家族促凋亡基因Bad,GSK-3β,細胞色素C等的蛋白表達變化。結(jié)果顯示:心肌細胞中HSP90蛋白

6、和磷酸化Akt在缺氧后表達明顯增高,Akt下游效應(yīng)分子Bad和GSK-3β的磷酸化水平升高,說明P13K/Akt信號通路在心肌細胞缺氧早期也被激活。用GA抑制HSP90活性后Akt和Bad的磷酸化被阻斷,從線粒體釋放至細胞漿的細胞色素C明顯增加,說明HSP90的心肌保護作用與P13K/Akt信號通路相關(guān),即HSP90保持Akt的磷酸化穩(wěn)定性并促進Akt下游底物Bad的磷酸化,抑制細胞色素C從心肌細胞線粒體的釋放,從而起到抗凋亡的作用。<

7、br>　　 另一方面,我們檢測HSP90是否具有抗β腎上腺素能受體過度激活誘導(dǎo)的心肌細胞死亡的作用。我們利用異丙腎上腺素(Isoproterenol,ISO)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的成年小鼠心肌細胞死亡,模擬嚴(yán)重?zé)齻螃履I上腺素能受體持續(xù)激活誘導(dǎo)心肌細胞死亡。結(jié)果顯示ISO對心肌細胞具有明顯的細胞毒作用(導(dǎo)致心肌細胞壞死);用GA抑制HSP90后,ISO對心肌細胞的細胞毒作用不受影響,提示HSP90對GA對β腎上腺素能受體過度激活導(dǎo)致的心肌損傷

8、無保護作用。
　　 我們進一步探討了β腎上腺素能受體過度激活導(dǎo)致心肌細胞死亡的作用機制,并尋求針對該損傷因素的心肌保護方法。研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重?zé)齻l(fā)生后心肌細胞中出現(xiàn)大量的游離鈣累積(鈣超載),而且燒傷后通過細胞膜L型鈣通道(LTCC)進入胞內(nèi)的鈣內(nèi)流明顯增加。因為LTCC是β腎上腺素能受體信號系統(tǒng)的重要底物蛋白,本實驗假設(shè):β腎上腺素能受體過度激活是通過增加經(jīng)LTCC的鈣內(nèi)流導(dǎo)致心肌細胞壞死。因為LTCC和β腎上腺素能受體相互作用密

9、切,以往的研究沒有將二者有效分離開來研究其分別機制。本實驗利用LTCC亞基p2a轉(zhuǎn)基因小鼠模型首次檢測了β腎上腺素能受體和LTCC在心肌細胞死亡中各自獨立的作用機制。
　　 我們原代分離成年野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠的心室肌細胞后進行體外培養(yǎng),然后檢測各種藥物干預(yù)情況下(包括β腎上腺素能受體非選擇性激動劑ISO、其他β腎上腺素能受體調(diào)節(jié)藥物、鈣調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控藥物、caspase和活性氧簇抑制劑等)心肌細胞的生存率。同時我們還觀察了β腎上

10、腺素能受體各亞型的不同作用機制。
　　 我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)基因心肌細胞在培養(yǎng)中的細胞死亡率明顯高于野生型心肌細胞。野生型和轉(zhuǎn)基因心肌細胞的死亡率都被ISO加重,但是ISO不增加轉(zhuǎn)基因心肌細胞的LTCC大小,LTCC抑制劑Nifedipine只能部分抑制心肌細胞死亡。這些結(jié)果表明ISO誘導(dǎo)的心肌細胞死亡具有LTCC依賴和非依賴的兩種機制。ISO通過增強肌漿網(wǎng)Ca2+ ATP酶(鈣泵,SERCA),鈉/鈣交換蛋白(NCX)和鈣/鈣調(diào)

11、蛋白依賴性激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的功能增加野生型和轉(zhuǎn)基因心肌細胞的收縮功能。Caspase和ROS抑制劑不能減少LTCC或ISO導(dǎo)致的心肌細胞死亡。激活β腎上腺素能受體具有一定的心肌保護作用。這些結(jié)果提示β腎上腺素能受體持續(xù)激活導(dǎo)致的心肌細胞壞死主要是通過β1腎上腺素能受體介導(dǎo)的LTCC增加的機制,但其他的機制參與不能排除。
　　 總之,我們的研究提示HSP90具有抗缺氧誘導(dǎo)的凋亡的心肌保護作用。我們的研究還提示:通過減少通過LT