特異性TCR基因轉(zhuǎn)染記憶性T細(xì)胞抗腫瘤免疫的研究.pdf

1、背景和目的:
　　 免疫治療為腫瘤提供了一種有吸引力的療法，其優(yōu)勢(shì)是在增強(qiáng)或重建患者的抗腫瘤免疫的同時(shí)副作用較小。目前已有兩種主要策略被用于刺激抗腫瘤免疫。包括腫瘤治療性疫苗(therapeutic vaccination)和過(guò)繼性細(xì)胞治療(adoptivecell therapy)。其中過(guò)繼性細(xì)胞治療主要是指向荷瘤宿主體內(nèi)回輸自體或異體免疫細(xì)胞，如以腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞為主要成分的CTL細(xì)胞，腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（tumor-inf

2、iltrating lymphocyte，TIL）等。腫瘤反應(yīng)性CTL細(xì)胞回輸已被成功應(yīng)用于黑色素瘤，EB病毒誘導(dǎo)淋巴瘤(Epstein-Barr Virus)等腫瘤的臨床治療。
　　 然而目前將過(guò)繼性細(xì)胞治療廣泛應(yīng)用于大多數(shù)非病毒相關(guān)實(shí)體瘤中還存在不少問(wèn)題亟待解決，包括:1）如何獲得充分?jǐn)?shù)量的腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞是決定過(guò)繼性細(xì)胞治療效果的最關(guān)鍵因素。2）目前回輸?shù)拿庖呒?xì)胞尤其是克隆化CD8+T細(xì)胞在體內(nèi)難以長(zhǎng)期存活，極大的影響了過(guò)

3、繼性細(xì)胞治療的臨床療效。
　　 過(guò)繼性T細(xì)胞治療的一個(gè)重要限制是，由于腫瘤缺乏抗原性，僅能從部分患者體內(nèi)分離獲得高親和力(highly avidity)T細(xì)胞。為解決此問(wèn)題，研究者從患者TIL細(xì)胞中篩選獲得了反應(yīng)性T細(xì)胞克隆，繼而鑒定了可特異性識(shí)別腫瘤抗原的T細(xì)胞受體(T Cell Receptor，TCR)基因，再將編碼腫瘤特異性TCR的基因?qū)氤墒霻細(xì)胞，獲得的TCR基因修飾T細(xì)胞(TCR gene engineered T

4、cell)可在體外特異性識(shí)別抗原陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，并在回輸患者體內(nèi)后建立抗腫痛免疫。TCR基因修飾T細(xì)胞首先在黑色素瘤中開(kāi)展了臨床試驗(yàn)，將MART-1抗原特異的TCR基因轉(zhuǎn)入黑色素瘤病人的外周血淋巴細(xì)胞(Peripheral BloodLymphocyte，PBL)，回輸后可在患者體內(nèi)建立針對(duì)抗原陽(yáng)性腫瘤的免疫能力，部分患者可見(jiàn)腫瘤完全轉(zhuǎn)歸。用NY-ESO-1抗原特異性TCR基因修飾的T細(xì)胞(NY-ESO-1 TCR gene engine

5、ered T cell)在以黑色素瘤和滑膜肉瘤(metastaticsynovial cell sarcoma refractory)患者為對(duì)象的臨床試驗(yàn)中也獲得了類(lèi)似結(jié)果。
　　 決定TCR基因修飾T細(xì)胞體內(nèi)抗腫瘤效果的關(guān)鍵問(wèn)題是，鑒定可識(shí)別腫瘤抗原的TCR，并選擇適用于過(guò)繼性細(xì)胞治療的T細(xì)胞亞群(subset)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染修飾。
　　 從分化狀態(tài)上可將T細(xì)胞分為幼稚性T細(xì)胞(naive T cell)、效應(yīng)性T細(xì)胞（

6、effecor T cell，TE）和記憶性T細(xì)胞(memory T cell)。為獲得足夠數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞，T細(xì)胞通常需要在回輸前經(jīng)歷體外刺激活化，在此過(guò)程中獲得效應(yīng)表型（effector phenotype）將極大的影響其回輸體內(nèi)后的存活能力，從而影響過(guò)繼性免疫治療的長(zhǎng)期抗腫瘤效果。與TE細(xì)胞相比，記憶性T細(xì)胞具有的自我更新能力使其可在體內(nèi)長(zhǎng)期生存，并在再次遭遇相同抗原快速動(dòng)員，有望在回輸體內(nèi)后建立更長(zhǎng)期的抗腫瘤免疫。其中記憶性T細(xì)胞

7、又可根據(jù)表型，歸巢(homing)能力，和功能的差異分為效應(yīng)型記憶性T細(xì)胞(effector memory T cell，TEM)和中樞型記憶性T細(xì)胞(central memory T cell，TCM)[11]。TCM在細(xì)胞膜表面表達(dá)CD62L和CCR7分子，可促進(jìn)TCM歸巢至淋巴結(jié)，并在再次暴露于相同抗原時(shí)快速增殖。以豚尾猴(macaques)為模型的研究證實(shí)，來(lái)源于TCM活化產(chǎn)生的效應(yīng)型T細(xì)胞可再次獲得TCM表型，并在回輸體內(nèi)后長(zhǎng)

8、期存活。從而為機(jī)體提供長(zhǎng)期免疫保護(hù)。
　　 本研究將采用以下策略提供具有更強(qiáng)生存能力和免疫效應(yīng)功能的腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞用于過(guò)繼性細(xì)胞治療:
　　 研究策略一:通過(guò)腫瘤特異性TCR轉(zhuǎn)染T細(xì)胞賦予其腫瘤識(shí)別功能。
　　 本實(shí)驗(yàn)室從一直從事腫瘤特異性TCR的篩選與功能研究。在前期研究中利用基因優(yōu)勢(shì)取用技術(shù)篩選獲得了可特異性識(shí)別肝癌抗原的TCRVα12.2-Vβ7.1基因。我們將通過(guò)肝癌特異性的的TCRVα12.2-Vβ7

9、.1基因賦予T細(xì)胞抗原識(shí)別特異性，使其有效識(shí)別殺傷腫瘤細(xì)胞。
　　 研究策略二:腫瘤特異性TCR基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞活化誘導(dǎo)記憶性T細(xì)胞分化。
　　 研究腫瘤特異性TCR基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞被腫瘤抗原充分激活后，記憶性T細(xì)胞的分化情況，并明確其表型和腫瘤反應(yīng)性，為進(jìn)一步獲得TCR基因轉(zhuǎn)染記憶性T細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。
　　 研究策略三:腫瘤特異性TCR基因轉(zhuǎn)染純化后中樞型記憶性T細(xì)胞(TCM)由于記憶性T細(xì)胞的抗腫瘤免疫能力和體內(nèi)生

10、存能力都強(qiáng)于混合成分的CD8+T細(xì)胞。而T細(xì)胞的內(nèi)在性質(zhì)決定了其回輸體內(nèi)后的生存能力和長(zhǎng)期免疫功能。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了直接用腫瘤特異性TCR基因轉(zhuǎn)染純化的TCM，并明確其表型特征與抗腫瘤免疫效應(yīng)，以期為過(guò)繼性回輸提供更優(yōu)化的免疫效應(yīng)細(xì)胞。
　　 第一部分、腫瘤特異性TCR基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)記憶性T細(xì)胞分化促進(jìn)抗腫瘤免疫
　　 目的：研究TCR基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞被腫瘤抗原激活后，記憶性T細(xì)胞的分化情況，并明確其表型和免疫功能，為進(jìn)一步

11、獲得TCR基因轉(zhuǎn)染記憶性T細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.T細(xì)胞的培養(yǎng)、刺激與轉(zhuǎn)染。
　　 (1)密度梯度離心法分離人外周血單核細(xì)胞(peripheral blood monocyte，PBMC)。
　　 (2)體外以協(xié)同刺激分子單抗/細(xì)胞因子初次刺激活化T細(xì)胞（培養(yǎng)后第1天）;
　　 (3)重組人腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV轉(zhuǎn)染T細(xì)胞（培養(yǎng)后第3天）
　　 (4)流式細(xì)

12、胞術(shù)檢測(cè)腺病毒轉(zhuǎn)染后外源TCR基因表達(dá)效率（轉(zhuǎn)染后3-14天）;
　　 (5)人TAP缺陷型T2細(xì)胞負(fù)載HLA-A2+AFP218-226表位9肽(LLNQHACAV)再次刺激活化PBMC及TCR基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞（培養(yǎng)后第5天）
　　 2.TCR基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞體外經(jīng)腫瘤抗原刺激后表型變化流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TCR基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞經(jīng)腫瘤抗原刺激后CD45RO、CD62L、CD44等標(biāo)志性分子表達(dá)比例及動(dòng)態(tài)變化（刺激后3-14天）。<

13、br>　　 3.TCR基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞經(jīng)腫瘤抗原刺激后體外抗腫瘤免疫功能
　　 (1) CTL活性:腫瘤抗原再次刺激后24小時(shí)，各組效應(yīng)T細(xì)胞(PBMC對(duì)照組，經(jīng)抗原刺激PBMC，TCR基因轉(zhuǎn)染組，經(jīng)抗原刺激TCR基因轉(zhuǎn)染組）。以不同效靶比作用于各組腫瘤細(xì)胞HepG-2(HLA-A2+AFP+)，SMMC-7721(HLA-A2+AFP+),MCF-74(HLA-A2+AFP-)4小時(shí)，MTT法檢測(cè)腫瘤殺傷活性。
　　

14、(2)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡:再次刺激后24小時(shí)，各組效應(yīng)T細(xì)胞以30∶1的效靶比作用于靶細(xì)胞HepG-24小時(shí)，Annexin-V雙染法檢測(cè)靶細(xì)胞凋亡率。并以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組效應(yīng)T細(xì)胞表面FasL表達(dá)比例。
　　 (3)細(xì)胞因子分泌:各組效應(yīng)T細(xì)胞以30∶1的效靶比作用于靶細(xì)胞HepG-224小時(shí)后，ELISA法檢測(cè)效應(yīng)T細(xì)胞的細(xì)胞因子IFN-γ，IL-2分泌。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示

15、。應(yīng)用SPSS(R) v16.0軟件(SPSS Inc.，Chicago，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各指標(biāo)先進(jìn)行正態(tài)性及Levene's test方差齊性檢驗(yàn)。兩因素兩水平數(shù)據(jù)比較采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析（不同組細(xì)胞腫瘤殺傷活性比較，腫瘤細(xì)胞凋亡率比較，T細(xì)胞表面FasL表達(dá)比例分析，各組細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌）。采用重復(fù)測(cè)量的方差分析完成各組細(xì)胞不同時(shí)間地點(diǎn)TCRVβ7表達(dá)比例分析。采用單因素方差分析對(duì)不同MOI值轉(zhuǎn)染后TCR Vβ7陽(yáng)性

16、細(xì)胞比例進(jìn)行分析。當(dāng)P＜0.05時(shí)，被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.嵌合型腺病毒載體Ad5F35-TRAV-TRBV可以有效轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，在感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為100時(shí)，具有最高的轉(zhuǎn)染效率(17.120±0.983％)，與其余各組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)(n=5)外源TCR陽(yáng)性T細(xì)胞比例在轉(zhuǎn)染三天后約為30％。外源TCR陽(yáng)性T細(xì)胞比例隨轉(zhuǎn)

17、染后時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低。
　　 2.腫瘤抗原特異性TCR基因轉(zhuǎn)染能有效賦予T細(xì)胞抗原識(shí)別特異性，TCR基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞經(jīng)腫瘤抗原刺激后充分活化，CD45RO+細(xì)胞比例逐漸上升。在活化后第14天，轉(zhuǎn)染+刺激組CD45RO+細(xì)胞比例最高（39.150±4.005％），與其它各組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)(n=4)。抗原有效刺激啟動(dòng)了記憶性T細(xì)胞的分化過(guò)程，CD62L、CD44抗體染色結(jié)果顯示，CDRO+細(xì)胞中主要以CD62L

18、-CD44+細(xì)胞(TE，TEM)為主。隨著抗原刺激后時(shí)間的延長(zhǎng)，CD62L+細(xì)胞在CD45RO+細(xì)胞中比例逐漸上升。最終出現(xiàn)明顯的CD62L+CD44+TCM亞群。
　　 3.腫瘤特異性TCR基因轉(zhuǎn)染能夠促進(jìn)T細(xì)胞殺傷AFP+靶細(xì)胞HepG-2（轉(zhuǎn)染組:25.479±8.574％，對(duì)照組:6.107±1.047％），SMMC-7721（轉(zhuǎn)染組:24.368±8.411％，對(duì)照組:6.024±1.269％）。差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

19、P＜0.001)(n=5)。通過(guò)AFP抗原預(yù)先刺激，進(jìn)一步提高TCR基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的腫瘤殺傷活性（HepG-2:33.467±12.625％，SMMC-7721:32.027±12.309％）。與單獨(dú)轉(zhuǎn)染組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。TCR基因轉(zhuǎn)染和AFP刺激對(duì)TE細(xì)胞裂解AFP-的靶細(xì)胞MCF-7無(wú)明顯影響(P＞0.05)。提示TCR基因轉(zhuǎn)染具有良好的抗原特異性。
　　 4.腫瘤特異性TCR基因轉(zhuǎn)染能夠有效促進(jìn)

20、T細(xì)胞誘導(dǎo)靶細(xì)胞HepG-2凋亡（轉(zhuǎn)染組:16.400±1.272％，對(duì)照組:1.375±0.573％），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)(n=4)。AFP抗原預(yù)先刺激使靶細(xì)胞凋亡比例進(jìn)一步增加（轉(zhuǎn)染+刺激組:28.750±4.160％），與單獨(dú)轉(zhuǎn)染組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。同時(shí)，TCR基因轉(zhuǎn)染能夠有效促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞在作用于靶細(xì)胞后表達(dá)免疫效應(yīng)分子FasL（轉(zhuǎn)染組:14.700±1.706％，對(duì)照組:1.725±

21、0.427％），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)(n=4)?？乖碳つ軌蜻M(jìn)一步促進(jìn)FasL表達(dá)（轉(zhuǎn)染+刺激組:27.650±2.686％），與單獨(dú)轉(zhuǎn)染組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。T細(xì)胞表面上調(diào)表達(dá)的FasL可通過(guò)FasL-Fas途徑誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。
　　 5.腫瘤特異性TCR基因轉(zhuǎn)染能夠促進(jìn)T細(xì)胞作用于靶細(xì)胞HepG-2后分泌細(xì)胞因子IFN-γ（轉(zhuǎn)染組:25.962±2.488ng/ml，對(duì)照組3.736±0

22、.412 ng/ml），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)(n=5)。特異性抗原的預(yù)先刺激活化使以上效果進(jìn)一步增強(qiáng)（轉(zhuǎn)染+刺激組:33.394±2.520ng/ml），與TCR基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）.。T細(xì)胞通過(guò)增加IFN-γ分泌介導(dǎo)抗腫痛免疫反應(yīng)。
　　 結(jié)論：
　　 TCR基因轉(zhuǎn)染能夠有效賦予T細(xì)胞抗原特異性，使其有效識(shí)別腫瘤抗原后活化。經(jīng)腫瘤抗原預(yù)先刺激充分活化的抗原特異性T細(xì)胞將啟動(dòng)

23、記憶性T細(xì)胞分化進(jìn)程，使效應(yīng)T細(xì)胞逐漸獲得TCM表型特征，并在再次遭遇表達(dá)相同抗原的腫瘤細(xì)胞時(shí)發(fā)揮更為強(qiáng)烈的免疫效應(yīng)功能。
　　 第二部分、TCR基因轉(zhuǎn)染中樞型記憶性T細(xì)胞促進(jìn)抗腫瘤免疫
　　 目的：從健康人CD8+T細(xì)胞中鑒定并純化TCM，研究體外活化后，CD8+T細(xì)胞與TCM來(lái)源的效應(yīng)T細(xì)胞(TE)細(xì)胞分化表型的差異。并以腫瘤抗原特異性TCR基因修飾TCM細(xì)胞，明確TCR基因修飾TCM細(xì)胞的抗腫瘤免疫功能。
　

24、　 方法：
　　 1.TCM的分選、刺激與TCR基因轉(zhuǎn)染
　　 (1)磁珠負(fù)性篩選CD8+T細(xì)胞，二次陽(yáng)性分選TCM；
　　 (2)協(xié)同刺激抗體/細(xì)胞因子初次刺激（培養(yǎng)后第1天）；
　　 (3)重組TCR腺病毒轉(zhuǎn)染（培養(yǎng)后第3天）CD8+T細(xì)胞及TCM。
　　 (4) HLA-A2+AFP218-226表位9肽(LLNQHACAV)再次刺激（培養(yǎng)后第5天）；
　　 (5)臺(tái)盼藍(lán)染色法獲取

25、CD8+T細(xì)胞及TCM體外刺激活化后生長(zhǎng)曲線(xiàn)（至體外培養(yǎng)第35天）；
　　 (6)流式細(xì)胞術(shù)-熒光原位雜交法(Flow-FISH)檢測(cè)活化后細(xì)胞數(shù)量高峰期（第14天）CD8+T細(xì)胞與TCM來(lái)源TE端粒相對(duì)長(zhǎng)度。
　　 2.CD8+T細(xì)胞與TCM來(lái)源TE細(xì)胞分化表型流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+T細(xì)胞與TCM經(jīng)刺激活化后CD45RO、CD62L、CD44、CCR7、CD28等標(biāo)志性分子表達(dá)及動(dòng)態(tài)變化（至體外培養(yǎng)后第33天）。

26、>　　 3.TCR基因轉(zhuǎn)染TCM來(lái)源TE的抗腫瘤免疫功能
　　 (1)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腺病毒轉(zhuǎn)染后外源TCR基因表達(dá)效率（轉(zhuǎn)染后3-14天）;
　　 (2) CTL活性:腫瘤抗原再刺激后一天，以鈣黃綠素標(biāo)記靶細(xì)胞（HepG-2，SMMC-7721，MCF-7）。檢測(cè)分別來(lái)源于CD8+T細(xì)胞，TCM，TCR基因轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞，TCR基因轉(zhuǎn)染TCM的各組TE不同效靶比對(duì)靶細(xì)胞的特異性裂解百分比。
　　 (3)抗體

27、阻斷實(shí)驗(yàn):抗人HLA-A2抗體與HLA-A2陽(yáng)性靶細(xì)胞HepG-2和SMMC-7721共孵育后，鈣黃綠素釋放法檢測(cè)抗體阻斷對(duì)TCR基因轉(zhuǎn)染TCM來(lái)源TE的CTL活性影響。
　　 (4)細(xì)胞裂解核蛋白分泌:腫瘤抗原再刺激后一天，各組TE細(xì)胞作用于靶細(xì)胞Hep-G2，SMMC7721后4小時(shí)。胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法檢測(cè)T細(xì)胞內(nèi)新合成的穿孔素與顆粒酶B分泌。
　　 (5)細(xì)胞因子分泌:腫瘤抗原再刺激后一天，各組TE細(xì)胞作用于靶細(xì)胞

28、HepG-2，SMMC7721，MCF-724小時(shí)后，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IFN-γ，IL-2含量。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。應(yīng)用SPSS(R) v16.0軟件(SPSS Inc.，Chicago，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各指標(biāo)先進(jìn)行正態(tài)性及Levene's test方差齊性檢驗(yàn)。兩因素兩水平數(shù)據(jù)比較采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析（不同組細(xì)胞腫瘤殺傷活性比較，抗體抑制試驗(yàn)，各組細(xì)胞的

29、細(xì)胞因子分泌）。采用重復(fù)測(cè)量的方差分析完成各組細(xì)胞不同時(shí)間地點(diǎn)細(xì)胞數(shù)量分析。采用單因素方差分析對(duì)不同組細(xì)胞端粒長(zhǎng)度進(jìn)行分析。當(dāng)P＜0.05時(shí)，被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.本研究分析了來(lái)自12個(gè)健康人樣本的CD8+T細(xì)胞，其CD62L+CD44+TCM比例在13-35％之間。選擇6個(gè)HLA-A2+樣本，分選獲得了純度高于97％的TCM。
　　 2.體外培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)協(xié)同刺激分子/細(xì)胞因子和

30、腫瘤抗原的兩輪刺激，誘導(dǎo)了TCM的效應(yīng)性分化，細(xì)胞數(shù)量在體外培養(yǎng)14天左右達(dá)到峰值。在此過(guò)程中，與CD8+T細(xì)胞相比，TCM來(lái)源TE具有更高的增殖倍數(shù)(第14天，TCM組細(xì)胞數(shù)量19.421±3.003×106/ml)，與CD8+T細(xì)胞組相比（第14天時(shí)細(xì)胞數(shù)目為14.533±1.874×106/ml），細(xì)胞數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-5.349，P＜0.001）(n=15)。在細(xì)胞數(shù)到達(dá)峰值后，TCM來(lái)源TE與CD8+T來(lái)源TE相比保

31、持了更為穩(wěn)定的細(xì)胞數(shù)量，更低的活化后細(xì)胞死亡比例。在第21天(t=-12.226，P＜0.001)，28天(t=-16.472，P＜0.001)，35天(t=-20.203，P＜0.001)，細(xì)胞數(shù)目差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TCM來(lái)源TE與CD8+T來(lái)源TE相比顯示了更長(zhǎng)的端粒長(zhǎng)度（TCM來(lái)源TE:1.005±0.053，CD8+T來(lái)源TE:0.968±0.017），但端粒長(zhǎng)度差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.228)（n=4）。
　　

32、3.在體外效應(yīng)分化過(guò)程中，TCM來(lái)源的TE細(xì)胞始終保持了一定程度的CD62L表達(dá)(＞10％)，CD44表達(dá)比例始終保持較高水平(85％)。在培養(yǎng)中晚期(21天后)，所有CD62L+細(xì)胞均為CD44high表型。從而重新獲得明顯的CD62L+CD44highTCM分群。而CD8+T細(xì)胞來(lái)源TE的CD62L+陽(yáng)性細(xì)胞比例逐漸下降至無(wú)法檢測(cè)。CD44+細(xì)胞比例逐漸降低至20％以下。
　　 4.作為T(mén)細(xì)胞活化標(biāo)志，CD45RO在TCM來(lái)

33、源TE中保持較穩(wěn)定的高水平表達(dá)(＞40％)，并在各時(shí)間點(diǎn)均高于CD8+T細(xì)胞來(lái)源TE。同時(shí)，CD28與CCR7分子在TCM來(lái)源TE中始終保持了一定比例的表達(dá)(＞19％)，而在CD8+T細(xì)胞來(lái)源TE中表達(dá)逐漸降至較低水平(＜10％)。
　　 5.通過(guò)嵌合型腺病毒載體Ad5F35-TRAV-TRBV，成功的將腫瘤特異性TCR轉(zhuǎn)染至TCM。外源性TCR陽(yáng)性T細(xì)胞比例在轉(zhuǎn)染后3天超過(guò)30％。此后隨著轉(zhuǎn)染后時(shí)間的延長(zhǎng)，外源性TCR陽(yáng)性T細(xì)

34、胞比例逐漸下降。
　　 6.TCR基因轉(zhuǎn)染有效促進(jìn)了TCM識(shí)別殺傷HLA-A2+AFP+靶細(xì)胞HepG-2（TCR基因轉(zhuǎn)染TCM組:32.382±14.311％，TCM組:10.566±2.034％）(n=6)和SMMC-7721(TCR基因轉(zhuǎn)染TCM組:29.512±12.246％，TCM組:10.878±2.114％)(n=6)。與TCR基因轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞相比（HepG-2:24.424±9.340％，SMMC-7721

35、:21.368±6.948％），以HepG-2為靶細(xì)胞時(shí)，TCR基因轉(zhuǎn)染TCM在效靶比為10∶1(P=0.04)和30∶1組(P=0.015)，特異性裂解百分比與基因轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以SMMC-7721為靶細(xì)胞時(shí)，TCR基因轉(zhuǎn)染TCM在效靶比為10∶1(P=0.007)和30∶1組(P=0.037)，特異性裂解百分比與基因轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 7.TCR基因轉(zhuǎn)染及AFP抗原預(yù)先刺激對(duì)

36、TCM來(lái)源TE裂解HLA-A2+AFP-靶細(xì)胞MCF-7的能力沒(méi)有顯著影響(P＜0.05)(n=6)。提示TCR基因轉(zhuǎn)染TCM來(lái)源TE的CTL活性具有良好的抗原特異性。
　　 8.通過(guò)HLA-A2抗體預(yù)先孵育HLA-A2+AFP+靶細(xì)胞HepG-2和SMMC-7721，有效阻斷了轉(zhuǎn)染TCR基因轉(zhuǎn)染TCM來(lái)源TE的CTL活性。以HepG-2為靶細(xì)胞時(shí)，抗體封閉后，在效靶比3∶1，10∶1，30∶1時(shí)靶細(xì)胞裂解百分比與抗體封閉前靶細(xì)

37、胞裂解百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.406，t=-20.945，t=-15.188;P=0.003，P＜0.001，P＜0.001)(n=10)。以SMMC7721為靶細(xì)胞時(shí)，抗體封閉后，在效靶比3∶1，10∶1，30∶1時(shí)靶細(xì)胞裂解百分比與抗體封閉前靶細(xì)胞裂解百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.021，t=-15.640，t=-12.443;P=0.001，P＜0.001，P＜0.001)(n=10)。提示TCR基因轉(zhuǎn)染TCM來(lái)源T

38、E的CTL效應(yīng)具有MHC限制性。
　　 9.TCR基因轉(zhuǎn)染有效促進(jìn)了TCM來(lái)源TE作用于靶細(xì)胞HepG-2和SMMC-7721后裂解核蛋白穿孔素與顆粒酶B的分泌。與TCR基因轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞相比，經(jīng)AFP抗原預(yù)先刺激的TCR基因轉(zhuǎn)染TCM再次遭遇抗原陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞時(shí)裂解核蛋白分泌明顯上升。
　　 10.TCR基因轉(zhuǎn)染有效促進(jìn)了TCM來(lái)源TE作用于靶細(xì)胞HepG-2和SMMC-7721后細(xì)胞因子IFN-γ分泌（作用于Hep

39、G-2時(shí)，TCR基因轉(zhuǎn)染TCM:35.761±7.311 ng/ml，TCM3.288±0.740 ng/ml;作用于SMMC-7721時(shí)，TCR基因轉(zhuǎn)染TCM:27.310±3.672ng/ml，TCM3.211±1.181ng/ml。）。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）與TCR基因轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞相比（作用于HepG-2時(shí)，27.920±3.722ng/ml;作用于SMMC-7721時(shí)，24.673±2.279ng/ml），經(jīng)