二甲雙胍促進記憶性T細胞分化及增強其抗腫瘤效應(yīng)的機制研究.pdf

1、研究背景和目的
　　免疫治療作為《科學(xué)》雜志評出的2013年十大突破之首，表現(xiàn)出對抗腫瘤的巨大潛力，也使之成為繼外科手術(shù)、放療、化療之后第四類已被證明具有顯著優(yōu)勢的抗腫瘤療法。其中，過繼性細胞免疫治療已經(jīng)成為癌癥治療的重要手段之一，并在臨床試驗中取得了顯著的治療效果。嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T cells, CAR-T）治療作為過繼免疫治療的新興力量，使T細胞能夠特異且有效地殺傷腫瘤

2、細胞，顯著改善患者的預(yù)后。
　　然而，無論是傳統(tǒng)的過繼免疫細胞療法還是新型的CAR-T療法，都尚未在實體瘤治療中取得突破性進展。究其原因，一方面由于腫瘤微環(huán)境的存在影響T細胞的活化和代謝：（1）T細胞活化后抑制性受體上調(diào)，而腫瘤細胞通過表達相應(yīng)配體抑制 T細胞功能；（2）微環(huán)境中的腫瘤細胞競爭性攝取葡萄糖，抑制 T細胞的糖酵解，進而抑制 T細胞的分化和記憶性的形成。另一方面，由于體外擴增培養(yǎng)的 T細胞大多處于終末分化狀態(tài)，難以在患

3、者體內(nèi)發(fā)揮持續(xù)、長久的抗腫瘤效應(yīng)。如何獲得分化狀態(tài)低、抗腫瘤能力強的 T細胞是目前過繼性細胞免疫治療領(lǐng)域研究的熱點。因此，探討記憶性 T細胞分化的機制，獲得更多年輕化T細胞用于免疫治療的研究十分必要。
　　記憶性T細胞是一群異質(zhì)性細胞，包括干細胞樣T細胞（T memory stem cell, Tscm）、中心記憶性 T細胞（central memory cell, Tcm）和效應(yīng)記憶性 T細胞（effector memory c

4、ell, Tem）等。其中Tscm和Tcm亞群在體內(nèi)的增殖和抗腫瘤活性均優(yōu)于Tem和效應(yīng)性T細胞（effector T cell, Teff）。代謝檢測點和信號通路分子是調(diào)控記憶性 T細胞分化過程的關(guān)鍵因素。因而，探討如何通過體外藥物誘導(dǎo)干預(yù)獲得記憶性T細胞的研究已成為當(dāng)前熱點。AMPK是促進記憶性T細胞形成的關(guān)鍵信號通路分子，也是T細胞重要的代謝檢測點，而臨床II型糖尿病的一線用藥二甲雙胍（metformin）能夠顯著激活A(yù)MPK通路

5、。二甲雙胍殺傷腫瘤細胞的研究已有報道，但是二甲雙胍能否通過激活A(yù)MPK促進記憶性T細胞形成及增強其抗腫瘤效應(yīng)的機制尚不清楚。
　　肺癌在我國發(fā)生率和死亡率逐年增長，使得肺癌超越其他惡性腫瘤成為致死率第一的腫瘤。盡管手術(shù)、化療、放療和靶向治療等治療手段和方案取得了較大進展，但是肺癌患者的5年生存率僅為16.1％。目前，肺癌已經(jīng)發(fā)展成為我國公共健康的焦點問題。盡管CAR-T細胞治療在實體瘤中取得了一定的療效，但是尚未有關(guān)于肺癌治療的研

6、究。此外，CAR-T細胞的持久性及記憶性影響其在體內(nèi)的生存和抗腫瘤效應(yīng)。因而，我們將以肺癌為模型探討二甲雙胍能否促進CAR-T細胞的記憶性，增強CAR-T治療肺癌的效果。
　　本文主要探討了二甲雙胍通過激活A(yù)MPK信號通路，抑制miR107的表達進而增加轉(zhuǎn)錄因子Eomes的表達水平，促進記憶亞群Tscm和Tcm細胞比例上調(diào)。同時，二甲雙胍促進記憶性CAR-T細胞的形成及增強體、內(nèi)外對肺癌細胞的殺傷能力。進一步驗證二甲雙胍改善肺癌合

7、并糖尿病患的預(yù)后，促進體內(nèi)記憶性細胞的形成，為臨床過繼性細胞免疫治療提供新的思路和實驗依據(jù)。
　　實驗方法
　　1）流式細胞術(shù)檢測患者來源的CD8+ T細胞中各亞群的比例、表面標志物表達和胞內(nèi)因子的分泌水平。
　　2）流式細胞術(shù)檢測體外培養(yǎng)時二甲雙胍對 CD8+T細胞分化和分泌胞內(nèi)因子水平的影響。
　　3）細胞免疫熒光分析二甲雙胍對CD8+T細胞PD-1表達的影響。
　　4）采用Annexin-V/PI雙染

8、法檢測二甲雙胍對CD8+T細胞凋亡的影響。流式分選Tscm和Tcm亞群，采用qRT-PCR檢測抗凋亡基因Bcl2和Bcl6的表達水平。
　　5）qRT-PCR法檢測T細胞分化相關(guān)基因和microRNA的表達水平。
　　6）Western blot檢測相關(guān)信號通路蛋白的表達。
　　7）雙熒光報告實驗驗證miR107與Eomes的靶向關(guān)系。
　　8）利用海馬能量檢測系統(tǒng)分析T細胞的糖酵解水平。
　　9）構(gòu)建靶向

9、HER2抗原的CD8+CAR-T細胞，分析二甲雙胍對HER2-CAR T細胞分化和抗腫瘤活性的影響。
　　10）流式細胞術(shù)檢測二甲雙胍處理的HER2-CAR T細胞對HER2高表達的靶細胞（A549和H460）以及HER2低表達的結(jié)直腸癌細胞系HCT-116的殺傷作用。
　　11）對肺癌合并糖尿病患者進行生存分析，探討二甲雙胍對肺癌患者預(yù)后的影響。
　　12）流式細胞術(shù)檢測肺癌患者外周血及腫瘤浸潤的CD8+T細胞亞群比

10、例、表面標志物的表達及胞內(nèi)因子的分泌水平。
　　13）采用免疫組化分析腫瘤浸潤T細胞的PD-1表達水平。
　　實驗結(jié)果
　　1）二甲雙胍在體內(nèi)促進記憶性 T細胞形成。服用二甲雙胍后糖尿病患者CD8+Tscm和Tcm亞群比例增加。
　　2）二甲雙胍在體內(nèi)增強T細胞功能。服用二甲雙胍后，糖尿病患者CD8+T細胞表面PD-1和Tim-3的表達水平降低，IFN-??和IL-2的分泌水平增強。
　　3）體外培養(yǎng)中二甲

11、雙胍處理增加了記憶性CD8+ T細胞比例。二甲雙胍處理3d和7d時，Tscm和Tcm亞群比例升高。
　　4）二甲雙胍抑制CD8+T細胞的凋亡。二甲雙胍上調(diào)CD8+ T細胞及Tscm和Tcm細胞亞群抗凋亡基因Bcl2和Bcl6的表達水平。
　　5）二甲雙胍上調(diào)與記憶性相關(guān)基因如 Eomes和 AMPK的表達，降低與效應(yīng)性相關(guān)基因如Prdm1和T-bet的表達。轉(zhuǎn)錄因子Eomes的表達水平在二甲雙胍處理的T細胞中顯著升高。

12、>　　6）二甲雙胍激活A(yù)MPK信號通路，抑制其下游mTOR及S6通路。
　　7）AMPK抑制miR107上調(diào)Eomes的表達。
　　8）二甲雙胍降低CD8+T細胞糖代謝水平，有利于記憶性的形成和維持。
　　9）二甲雙胍促進記憶性HER2-CAR T細胞的形成。HER2-CAR轉(zhuǎn)染T細胞效率達到70%以上，并上調(diào)Tscm和Tcm亞群的比例。
　　10）二甲雙胍增強 HER2-CAR T細胞的抗腫瘤效應(yīng)。二甲雙胍能夠

13、增加HER2-CAR T細胞表達脫顆粒標志物 CD107a的水平。同時促進 IFN-??和 IL-2的分泌、增強HER2-CAR T細胞殺傷A549和H460的能力，而對低表達HER2的結(jié)直腸癌細胞系HCT-116的殺傷功能較弱。
　　11）建立肺癌移植瘤模型，對荷瘤小鼠進行治療發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍處理的HER2-CAR T細胞清除腫瘤效果更好。
　　12）二甲雙胍促進肺癌患者記憶性 T細胞的形成。服用二甲雙胍的患者生存時間較對照

14、組患者延長7個月以上，且外周血CD8+T細胞及TIL細胞中Tscm和Tcm亞群比例均較對照組Tscm和Tcm比例增加。
　　13）二甲雙胍降低肺癌患者T細胞表面PD-1的表達。服用二甲雙胍的患者外周血及腫瘤浸潤的CD8+T細胞PD-1的表達水平均降低。
　　14）二甲雙胍增強促炎性細胞因子的分泌水平。二甲雙胍組患者外周血及腫瘤浸潤的CD8+T細胞分泌的IFN-??和IL-2的水平均較對照組患者顯著增加。
　　結(jié)論