小鼠Il-17A和Il-17AshRNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建及功能鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分小鼠IL-17A基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建及功能鑒定
   目的:構(gòu)建小鼠IL-17A基因真核表達載體,在293T細胞中驗證其表達IL-17A的能力。
   方法:根據(jù)Genbank中小鼠IL-17AmRNA序列(NM010552.3)設(shè)計PCR引物,兩端分別引入限制性內(nèi)切酶酶切位點,提取小鼠脾臟組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA,以此為模板進行目的基因的擴增,將目的基因亞克隆至T載體中,重組T載體經(jīng)雙酶切及測序鑒定正確

2、后,雙酶切重組T載體,回收目的片段,在T4連接酶作用下定向克隆至真核質(zhì)粒載體pLVX-IRES-ZsGreen1中,構(gòu)建IL-17A基因真核表達載體LVX-IL-17A-IRES-ZsGreen1,進行雙酶切及測序鑒定。表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞,用Real-time PCR法檢測轉(zhuǎn)染24h、48h后細胞IL-17AmRNA的表達量,用ELISA法檢測轉(zhuǎn)染24h、48h后細胞培養(yǎng)上清中IL-17A表達量。
   結(jié)果:重組T載體及

3、真核表達載體雙酶切后電泳可見約500bp片段,與目的基因大小相符,測序結(jié)果與IL-17A基因進行BLAST比對分析完全吻合。與未轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染24h、48h后細胞IL-17AmRNA表達水平均明顯增高,細胞上清中IL-17A表達水平均明顯增高。
   結(jié)論:本研究從小鼠脾臟組織中成功克隆了IL-17A基因,構(gòu)建了高表達小鼠IL-17A的真核表達質(zhì)粒,為今后研究IL-17A在腎小球疾病中的作用及分子機制提供了基礎(chǔ)。

4、   第二部分小鼠IL-17AshRNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建及抑制IL-17A表達的有效序列篩選
   目的:構(gòu)建3個小鼠IL-17AshRNA表達質(zhì)粒,在293T細胞中驗證其抑制IL-17A表達的能力并篩選出抑制效率最佳的序列。
   方法:根據(jù)GenBank中小鼠IL-17AmRNA序列(NM_010552.3),利用Invitrogen公司網(wǎng)站在線設(shè)計軟件設(shè)計3條shRNA序列及1條陰性對照序列,兩端分別引入限制性內(nèi)切

5、酶酶切位點,合成Oligo DNA,退火形成雙鏈后,在T4 DNA連接酶作用下定向克隆至真核載體pLVX-shRNA中,獲得3個shRNA表達質(zhì)粒和1個陰性對照質(zhì)粒(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNAC),并進行測序鑒定。293T細胞分為空白對照組、shRNA1組、shRNA2組、shRNA3組、shRNAC組,各組分別進行各干擾質(zhì)粒和表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,用Real-time PCR法檢測轉(zhuǎn)染24h、48h后細胞IL-17

6、AmRNA的表量達,用ELISA法檢測轉(zhuǎn)染24h、48h后細胞培養(yǎng)上清中IL-17A表達量。
   結(jié)果:各shRNA表達質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒測序結(jié)果與Oligo DNA完全一致;與shRNA C組相比,shRNA1、shRNA2、shRNA3組轉(zhuǎn)染后24h、48h細胞IL-17A基因mRNA水平顯著降低,shRNA1表達水平最低;細胞培養(yǎng)上清中IL-17A表達水平與mRNA表達水平一致。
   結(jié)論:成功構(gòu)建3個小鼠IL

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