IL-17A拮抗劑對成纖維細胞增殖和窖蛋白-1表達的影響.pdf

1、 目的：觀察IL-17A拮抗劑對成纖維細胞增殖、羥脯氨酸分泌及細胞因子表達的影響,探討IL-17A拮抗劑干預肺纖維化的分子機制,為臨床選用IL-17A拮抗劑治療IPF提供理論和實驗依據。方法：取10只清潔級雌性Wistar 大鼠,采用隨機數字表法分為生理鹽水(normal saline,NS)組和博來霉素(bleomycin,BLM),每組各5只。NS組、BLM組大鼠分別于氣管內灌注生理鹽水和博萊霉素,并于氣管內灌注后第7天心臟采血處

2、死,行右肺灌洗,并分離、純化肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage,AM)并培養(yǎng)24小時后分別取兩組AM培養(yǎng)上清,取左肺行病理切片及HE染色。將大鼠成纖維細胞(208F細胞)分為對照組、模型組、抗體組(抗A組、抗B組、抗C組)培養(yǎng),各組培養(yǎng)基分別為：NS組AM培養(yǎng)上清、BLM組AM培養(yǎng)上清、BLM組AM培養(yǎng)上清+不同濃度IL-17A抗體(0.5μg/L、1μg/L、2μg/L)。分別于第24小時、48小時和72小時用CCK

3、-8檢測208F細胞培養(yǎng)增殖。于第 24 小時應用酶聯(lián)免疫分析( enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)檢測 208F 培養(yǎng)上清中的羥脯氨酸含量,免疫細胞化學檢測208F窖蛋白-1的表達,實時熒光定量聚合酶聯(lián)反應(real time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)檢測208F中Ⅰ型膠原和窖蛋白-1mRNA的表達。結果：(1)病理切片HE染色顯示：NS組大鼠肺

4、組織：肺泡結構完整,肺泡間隔無水腫及炎性細胞浸潤,肺泡腔亦無炎性細胞滲出；BLM組肺泡間隔增寬增厚、充血水腫明顯、炎性細胞浸潤嚴重,肺泡腔可見較大炎性細胞。(2)CCK-8結果顯示：與對照組相比,模型組208F細胞增殖水平在各個時間點均明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),抗體組中各組208F細胞增殖水平在各個時間點也增高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比,各個抗體組中208F 細胞增殖水平在各個時間點均降低,差異

5、均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；抗體組中,抗A組208F細胞增殖水平在各個時間點均高于其他兩組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而抗B組和抗C組208F細胞增殖水平在各個時間點均無明顯差異(P>0.05)。(3)ELISA 結果提示：與對照組相比,模型組和各個抗體組208F細胞培養(yǎng)上清中羥脯氨酸水平明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比,各個抗體組中培養(yǎng)上清中羥脯氨酸水平均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；

6、抗體組中,抗A組208F細胞培養(yǎng)上清中羥脯氨酸均水平高于其他兩組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而抗B組和抗C組208F細胞培養(yǎng)上清中羥脯氨酸水平無明顯差異(P>0.05)。(4)免疫細胞化學結果提示：與對照組相比,模型組和各個抗體組 208F細胞窖蛋白-1水平均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比,各個抗體組208F細胞窖蛋白-1水平均增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；抗體組中,抗A組208F細胞窖蛋白

7、-1水平低于其他兩組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而抗B組和抗C組208F細胞窖蛋白-1水平無明顯差異(P>0.05)。(5)RT-PCR結果顯示：各組208F細胞窖蛋白-1mRNA 比較,與對照組相比,模型組和各個抗體組 208F 細胞窖蛋白-1mRNA水平均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比,各個抗體組208F細胞窖蛋白-1mRNA水平均增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；抗體組中,抗A組208F細

8、胞窖蛋白-1mRNA水平低于其他兩組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而抗 B 組和抗 C 組 208F 細胞窖蛋白-1mRNA水平無明顯差異(P>0.05)。各組208F細胞Ⅰ型膠原mRNA比較,與對照組相比,模型組和抗A組208F細胞Ⅰ型膠原mRNA水平增高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),抗 B 組和抗 C 組 208F 細胞Ⅰ型膠原mRNA無明顯差異(P>0.05)；與模型組相比,各個抗體組208F細胞Ⅰ型膠原mRNA均