視上核星形膠質細胞對急性腹腔高滲刺激引起的神經元反應的調節(jié)及其機制.pdf

1、為探索腹腔滲透壓感受器的信息傳至視上核（SON）和室旁核（PVN）之通路，信息通路各站（脊髓背角〈DHSC〉、延髓孤束核〈NTS〉和SON內星形膠質細胞和神經元對腹腔急性高滲刺激的反應及其相互關系，星形膠質細胞在滲透壓調節(jié)中的作用及調節(jié)機制，本研究進行了下列四組實驗。
　　實驗一外周和中樞神經元的軸突終末可直接終止于星形膠質細胞
　　目的：觀察周圍神經傳入纖維終末和中樞的傳入纖維終末是否直接終止于星形膠質細胞。
　　方

2、法：10只健康成年雄性SD大鼠被分為2組：
　　第1組為迷走神經切斷組，切斷左側頸部迷走神經干，動物成活30天。動物按常規(guī)免疫電鏡制片方法進行抗GFAP免疫電鏡染色。第2組為BDA順行示蹤組，將順行示蹤劑定位導入右側NTS內，5天后常規(guī)灌流固定，恒冷箱制片，取延髓切片觀察BDA的注射區(qū)，2套SON切片分別進行抗Vasopressin（VP）和抗GFAP的免疫熒光染色。Confocal顯微鏡下觀察計數。
　　結果：（1）電鏡下

3、在NTS內觀察到正常的Synapses（包括對稱性和非對稱性Synapses）和軸突終末與GFAP陽性的星形膠質細胞突起接觸形成
　　SynaptoidContacts。在迷走神經切斷側NTS內發(fā)現許多變性的軸突終末，它可單獨與神經元（胞體或樹突）、GFAP陽性的星形膠質細胞或同時與兩者接觸，形成SynaptoidContacts。
　?。?）BDA注射區(qū)局限于右側NTS，可見許多BDA標記的胞體和密集的纖維。在SON發(fā)現4

4、0％的BDA標記的纖維可與VP陽性神經元接觸，36％的BDA標記的纖維與GFAP陽性突起接觸。電鏡下也觀察到軸突終末與GFAP星形膠質細胞形成SynaptoidContacts。
　　結論：星形膠質細胞可直接與周圍神經或中樞神經的軸突終末接觸，形成SynaptoidContacts。
　　實驗二迷走神經至孤束核，孤束核至視上核的信息通路參與急性腹腔高滲刺激的調節(jié)
　　目的：探索腹腔滲透壓信息傳至SON和PVN的神經通路

5、及相關部位星形膠質細胞和神經元對急性腹腔高滲刺激的反應。
　　方法：30只SD大鼠被分為6組（5只/組）：第1組為正常對照組，大鼠不作任何處理；第2組為等滲刺激組（IS組），向腹腔注入4ml0.15mol/L鹽水；第3組為高滲刺激組（HS組），注入4ml1.54mol/L鹽水；第4組為兩側膈下迷走神經切斷加高滲刺激組（SDVplusHS組），在胃賁門處分離結扎并切斷兩側迷走神經，7天后給予高滲刺激；第5組為兩側內臟大神經切斷加高滲

6、刺激組（SNLplusHS組），在腹后壁分離、結扎并切斷兩側內臟大神經，7天后給予高滲刺激，所有動物常規(guī)固定，切斷前腦（含SON）、延髓（含NTS）和脊髓胸段；第6組為假手術加高滲刺激組。切片分別進行各自的雙重免疫熒光反應。
　　結果：（1）各組動物脊髓胸段背角內的星形膠質細胞和神經元未見到明顯的反應。
　　（2）HS組延髓NTS和最后區(qū)(AP)內Fos陽性神經元和GFAP陽性星形膠質細胞明顯增加，與IS組的差異顯著，這種增

7、加可被SDV所阻止，但不能被SNL所抑制。
　?。?）HS組SON內Fos陽性神經元顯著增多，星形膠質細胞由靜止型轉化為激活型，胞體變大，突起變粗，GFAP深染，平均熒光強度增強，SON-VGL平均厚度增加，Fos/GFAP雙標細胞增多。SDV可阻止HS引起的反應，SNL則不能。
　　結論：腹腔滲透壓感受器的信息是經迷走神經傳至NTS，由NTS發(fā)出的纖維至SON，不是經內臟大神經傳導，脊髓背角不參與此信息的傳遞，而NTS可能

8、起著重要作用。
　　實驗三急性腹腔高滲刺激后SON內神經元的反應依賴于星形膠質細胞的活性
　　目的：觀察急性腹腔高滲刺激后SON星形膠質細胞和神經元的反應及其相互關系。
　　方法：85只SD大鼠被分為5組：第1組正常對照組(n=5)處理；第2組為IS組(n=20)；第3組HS組（n=20）；第4組為氟代檸檬酸加高滲組（FCAplusHS組，n=20），預先向側腦室緩慢注入1nmol/1μ的FCA，2h后再給高滲刺激；第

9、5組為甘珀酸加高滲組（CBXplusHS組，n=20），預先向側腦室緩慢注入50μgCBX(10μg/μl,W/V)，2h后再給高滲刺激。以上動物除第1組外，其余各組均分別成活15，45，90和180min，每一時間點5只。常規(guī)灌流固定、切片，SON切片進行抗VP，抗Fos，抗Connexin43（Cx43），抗GFAP的單一或雙重免疫熒光染色。
　　結果：光鏡結果：（1）高滲刺激后SON星形膠質細胞反應明顯，表現為細胞被激活，胞

10、體變大，突起變粗，GFAP深染，平均熒光強度增強，SON-VGL厚度增厚，Fos/GFAP雙標細胞增加，Cx43表達明顯增加，以上反應在刺激后45min達到高峰。（2）高滲刺激后SONMNCs也被激活，Fos陽性胞核明顯增加，其高峰為90min。（3）FCA可明顯干擾星形膠質細胞和神經元兩者的反應，而CBX只抑制神經元的反應，不干擾星形膠質細胞的反應。
　　結論：高滲刺激后SON內星形膠質細胞反應敏感，在45min達到高峰，神經元

11、的Fos表達90min為高峰。神經元的活性依賴于星形膠質細胞的活性。
　　實驗四腹腔急性高滲刺激后SON星形膠質細胞經Cx43hemichannel釋放谷氨酸調節(jié)神經元的活性
　　目的：觀察高滲刺激后SON星形膠質細胞對神經元的調節(jié)及其機制。
　　方法：（1）光鏡制片，25只SD雄性大鼠被分為5組（5只/組）：第1組為正常對照組；第2組為IS組；第3組為HS組；第4組為FCAplusHS組；第5組為CBXplusHS組

12、。所有動物成活45min，常規(guī)固定、切片，切片進行抗NMDAR-2，抗glutamate，抗GFAP，抗Cx43，抗Cx32，抗Fos，抗VP等單一，雙重或三重免疫熒光染色。
　?。?）星形膠質細胞培養(yǎng)，取18天胎鼠的下丘腦，常規(guī)分離、純化培養(yǎng)星形膠質細胞2周，將培養(yǎng)細胞分為4組：第1組為等滲DMEM培養(yǎng)組；第2組為高滲DMEM處理組；第3組先用CBX處理30min后再移至等滲DMEM；第4組先用CBX處理30min后再移至高滲D

13、MEM。各組均處理1，3，5，10和15min。
　?。?）分別收上述各組培養(yǎng)液用HPLC檢測Glutamate和Taurine的含量。
　　（4）電鏡制片，另有10只大鼠分為IS組（5只）和HS組（5只），進行抗Cx43和抗NMDAR-2免疫電鏡染色。
　?。?）用3H放免測定檢測正常對照組，IS，HS，FCAplusHS，CBXplusHS，SDVplusHS，SNLplusHS各組血漿中VP的含量。
　　結

14、果：（1）腹腔高滲刺激后SON星形膠質細胞內glutamate表達明顯上調，FCA可干擾其上調，而CBX則不干擾。
　　（2）腹腔高滲刺激后SON神經元上的NMDAR-2的表達明顯上調，FCA和CBX均可阻止其上調。
　　（3）腹腔高滲刺激后SON神經元內VP的表達上升，FCA，CBX，SDV均抑制VP的上升，但SNL不抑制。
　?。?）培養(yǎng)的星形膠質細胞高滲刺激后，胞內glutamate的表達明顯上升，3min達到高

15、峰，以后下降。CBX加高滲刺激后glutamate的表達上升明顯，并一直維持在高位。
　　（5）HPLC檢測高滲刺激后培養(yǎng)液中glutamate含量明顯上升，而牛磺酸不上升。
　?。?）腹腔高滲刺激SON內Cx43hemichannels出現率明顯增加。
　　結論：腹腔高滲刺激激活SON星形膠質細胞，被激活的星形膠質細胞增加合成glutamate，并通過Cx43hemichannels釋放，作用于神經元上的NMDAR-