星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液對缺氧-復氧損傷神經(jīng)元的保護作用及其機制探討.pdf

1、背景：
　　由于人們物質(zhì)生活得到極大改善，老年人口逐年增加，導致罹患腦血管病人人數(shù)迅速增加，目前腦血管疾病已占我國致殘和致死性病因第一位，并且患病人數(shù)有逐年增多的趨勢，而缺血性卒中占腦血管疾病的80％～85％。缺血性卒中不僅對人類健康造成了巨大的威脅，還給患者家庭和社會帶來了嚴重的負面影響。然而，至今尚無一種對所有缺血性卒中有確切療效的治療方法，因此尋找新的治療缺血性卒中的方法非常必要。
　　在研究短暫性腦缺血發(fā)作過程中，發(fā)

2、現(xiàn)了腦組織的缺血預處理;缺血預處理在臨床中是一種不切實際的治療方法;為了消除缺血造成的創(chuàng)傷，有人提出了藥物預處理，即通過藥物激發(fā)或模擬機體內(nèi)源性物質(zhì)，如腺苷、緩激肽和一氧化氮(nitricoxide，NO)等而發(fā)揮保護作用。
　　腺苷(adenosine，Ado)及其受體在多種臟器缺血再灌注損傷的保護方面有重要作用。正常情況下腦細胞外液腺苷水平為30～300nmol/L，而在腦缺血等病理狀態(tài)下，可達到5～40umol/L，最多可達

3、正常時的200多倍。由此可見，急劇增加的腺苷可能是一種內(nèi)源性的神經(jīng)保護反應。
　　星形膠質(zhì)細胞(astrocyte，AS)主要存在于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，對神經(jīng)元有支持和營養(yǎng)作用。激活后的星形膠質(zhì)細胞可以釋放多種神經(jīng)遞質(zhì);當機體遇到組織缺血等病理狀態(tài)下時，星形膠質(zhì)細胞釋放的物質(zhì)會明顯增加，保護受損神經(jīng)元并加速病損神經(jīng)元的功能恢復。大量的體外細胞培養(yǎng)實驗也證實了星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液（astrocyte-conditionedmediu

4、m，ACM）中含有多種神經(jīng)元營養(yǎng)物質(zhì)，提示ACM的確能夠提高損傷神經(jīng)元的存活率并且加快其功能恢復。雖然星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元的保護作用已被學者們公認，但其作用機制不是很清楚，ACM對受損神經(jīng)元的營養(yǎng)作用也需進一步探討。
　　本課題利用原代細胞培養(yǎng)技術得到星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，建立模擬腦缺血再灌注損傷模型，用ACM、ACMa及ACM+a干預缺氧損傷的神經(jīng)元;倒置顯微鏡下觀察星形膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元形態(tài)學變化，流式細胞術檢測細胞凋亡結(jié)果:X

5、TT法測定其活性，利用免疫熒光技術和免疫細胞化學技術分別測定神經(jīng)元特異性稀醇化酶（neuron-specificenolase，NSE）強陽性細胞的表達量，各組神經(jīng)元細胞中caspase-3蛋白表達及活性檢測，應用Westernblot分析各組神經(jīng)元caspase-3的活性。以此來分析星形膠質(zhì)細胞與腺苷對缺氧/復氧損傷神經(jīng)元的保護作用，探討腺苷預處理后的星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液的營養(yǎng)性作用，從而進一步揭示腺苷對神經(jīng)系統(tǒng)的保護機制，為腺苷應用于

6、臨床治療腦血管疾病奠定理論基礎。
　　目的：
　　分析星形膠質(zhì)細胞與腺苷(adenosine，Ado)對缺氧/復氧神經(jīng)元損傷的保護作用，探討腺苷預處理后的星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液的營養(yǎng)性作用，從而顯示腺苷對神經(jīng)系統(tǒng)的保護機制，為腺苷應用于臨床治療腦血管疾病奠定理論基礎。
　　材料和方法：
　　體外培養(yǎng)SD大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞和海馬神經(jīng)元及大腦皮層神經(jīng)元，純化后建立模擬腦缺血再灌注損傷模型，收集再灌注18h的星形

7、膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液(Astrocyteconditionedmedium，ACM)和經(jīng)腺苷預處理的再灌注18h的星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液(ACMa)，然后用ACM、ACMa及ACM+a（ACM+含100μmol/L腺苷的DMEM液）以1∶5的濃度培養(yǎng)缺氧/復氧損傷神經(jīng)元;倒置顯微鏡下觀察星形膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元形態(tài)學變化，XTT法測定星形膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元活性，免疫熒光技術和免疫細胞化學技術分別測定膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillar

8、yacidicprotein，GFAP)、NSE強陽性細胞的表達量，利用ELISA試劑盒進行星形膠質(zhì)細胞乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）酶聯(lián)免疫分析，運用流式細胞術檢測細胞凋亡，按Promega公司的CaspACETMAssaySystem，Colorimetric試劑盒說明書進行各組神經(jīng)元caspase-3活性測定，應用Westernblot分析各組神經(jīng)元caspase-3的活性。
　　結(jié)果：

9、>　　光鏡觀察:正常組神經(jīng)元生長良好，形態(tài)規(guī)則，胞體橢圓，折光性好，突觸連接緊密呈網(wǎng)狀;模型組神經(jīng)元胞體變大不規(guī)則，折光性差，突觸明顯減少或消失;ACMa組、ACM+a組及ACM組細胞狀態(tài)介于兩者之間，總體肉眼觀察，其作用:ACMa＞ACM+a＞ACM。
　　流式細胞術檢測細胞凋亡結(jié)果:與正常組相比，模型組、ACMa組、ACM+a組和ACM組細胞凋亡均顯著增加;而ACMa組、ACM+a組和ACM組細胞凋亡顯著低于模型組，ACMa組

10、細胞凋亡顯著低于ACM+a組和ACM組，ACM+a組和ACM組細胞凋亡無明顯差異。
　　XTT法細胞活性檢測:模型組神經(jīng)元活力下降，OD值明顯低于正常對照組。ACMa組、ACM+a組及ACM組細胞活力均高于模型組，根據(jù)OD值，其作用:ACMa＞ACM+a＞ACM。
　　NSE的測定:ACMa組、ACM+a組及ACM組神經(jīng)元表達NSE的能力均較模型組提高，對染色結(jié)果陽性的細胞培養(yǎng)片進行圖像分析，其作用:ACMa＞ACM+a＞A

11、CM。
　　caspase-3的活性:ACMa組、ACM+a組及ACM組神經(jīng)元caspase-3的活性均較模型組下降，其作用:ACMa＞ACM+a＞ACM。
　　caspase-3活性測定結(jié)果顯示:與模型組相比，ACMa組、ACM+a組和ACM組神經(jīng)元細胞中Caspase-3活性均顯著降低;而ACMa組Caspase-3活性低于ACM+a組和ACM組，ACM+a組和ACM組細胞凋亡無明顯差異。
　　結(jié)論：
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