磁刺激通過(guò)PEA-15對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的影響及機(jī)制.pdf

1、背景及目的：
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞磷酸化蛋白PEA-15（Phosphoprotein enriched in astrocytes-15kDa）廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)，位于常染色體Iq21-22，其含有一個(gè)DED結(jié)構(gòu)域（death effector domain,DED）死亡效應(yīng)區(qū)，抑制細(xì)胞凋亡。ERK1/2（Extracellular signal-regulated kinases）參與細(xì)胞增殖、存活和細(xì)胞遷移等多種細(xì)胞進(jìn)程。磁刺激可

2、通過(guò)激活ERK通路，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移，并對(duì)中樞神經(jīng)損傷后的炎癥反應(yīng)等起到重要的神經(jīng)保護(hù)作用。PEA-15通過(guò)結(jié)合ERK1/2阻止其在細(xì)胞核中聚集，調(diào)控EKR1/2功能，其與磁刺激對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移作用密切相關(guān)。本研究主要是在體外實(shí)驗(yàn)中觀察磁刺激是否可通過(guò)調(diào)節(jié)PEA-15影響ERK1/2通路，調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移作用，并探討其作用機(jī)制。
　　資料與方法：
　　1.星形膠質(zhì)細(xì)胞的提取、培養(yǎng)、細(xì)胞免疫熒光鑒定：解剖新生1

3、-3天SD(Sprague-Dawley)大鼠獲取大腦皮質(zhì)組織，運(yùn)用差速貼壁技術(shù)分離培養(yǎng)，獲取星形膠質(zhì)細(xì)胞，并觀察其形態(tài)及生長(zhǎng)，然后應(yīng)用免疫熒光技術(shù)鑒定GFAP蛋白的表達(dá)。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組：體外劃痕試驗(yàn)，根據(jù)不同的磁刺激強(qiáng)度將實(shí)驗(yàn)分為3組：
　?、賹?duì)照組（不給予磁刺激，但細(xì)胞同其他刺激組置于同一環(huán)境中）；
　?、贏組（給予30％最大磁刺激強(qiáng)度）；
　?、跙組（給予60%最大磁刺激強(qiáng)度）。
　　3.干擾PE

4、A-15表達(dá)后劃痕試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組：
　　①A組（不給予磁刺激，進(jìn)行陰形siRNA轉(zhuǎn)染）；
　　②B組（不給予磁刺激，但對(duì)細(xì)胞進(jìn)行PEA-15 siRNA轉(zhuǎn)染，干擾PEA-15表達(dá)）；
　?、跜組（給予磁刺激，進(jìn)行陰性siRNA轉(zhuǎn)染）；
　?、蹹組（給予磁刺激，同時(shí)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，干擾PEA-15表達(dá)）。觀察劃痕愈合情況，并運(yùn)用Western Blot觀察PEA-15及其蛋白磷酸化的表達(dá)變化。利用熒光測(cè)定轉(zhuǎn)染效率

5、；Western Blot半定量測(cè)定干擾效果。
　　結(jié)果：
　　1.從新生1-3天大鼠腦皮質(zhì)中提取，經(jīng)差速貼壁分離、培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光鑒定膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP表達(dá)陽(yáng)性，DAPI染核測(cè)定細(xì)胞純度較高。
　　2.在體外劃痕實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著磁刺激強(qiáng)度的增加，劃痕面積愈合越快，在30%-60%最大磁刺激強(qiáng)度的強(qiáng)度下，星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移速度和強(qiáng)度呈正相關(guān)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　

6、　3.通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光提示該轉(zhuǎn)染試劑具有較高的轉(zhuǎn)染效率，對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行PEA-15蛋白的測(cè)定，Western Blot結(jié)果提示siRNA270具有最佳的干擾效果。劃痕實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染組與磁刺激組均較正常組遷移明顯。磁刺激組的P-PEA-15增加明顯。
　　結(jié)論：
　　1.差速貼壁結(jié)合搖床方法可培養(yǎng)純度較高的高星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　2.體外劃痕實(shí)驗(yàn)中，在磁刺激30%-60%的強(qiáng)度下可明顯促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移。
　　3.干