BB型BMPr-IB基因的克隆及其在山羊成纖維和顆粒細(xì)胞中的表達(dá)研究.pdf

1、FecB基因是在澳大利亞Booroola羊中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與高繁殖率相關(guān)的主效基因，后續(xù)的研究證明FecB基因?qū)崬楣切螒B(tài)發(fā)生蛋白Ⅰ型受體基因（Bone MorphogeneticProtein Receptor-IB，BMPR-IB）。研究發(fā)現(xiàn)，Booroola綿羊BMPR-IB堿基序列上存在1個(gè)A746G突變，使其所編碼的第249位氨基酸由谷氨酰胺突變?yōu)榫彼?Q→R)，引起蛋白結(jié)構(gòu)的變化，使攜帶該突變基因母羊的顆粒細(xì)胞分化和卵泡成熟速度

2、加快，從而使排卵數(shù)增加。目前研究表明，該突變?cè)谑澜绺鞯鼐d羊品種中均有分布，且與產(chǎn)羔數(shù)密切相關(guān)。但對(duì)多個(gè)山羊品種及奶山羊品種BMPR-IB基因的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，均未檢測(cè)到該突變。為在山羊細(xì)胞中引入BMPR-IB基因A746G突變，本研究從綿羊卵巢組織中克隆了BB型BMPR-IB基因全長(zhǎng)編碼區(qū)（去除終止密碼）序列，擴(kuò)增不同卵巢啟動(dòng)子片段對(duì)其在卵丘顆粒細(xì)胞中的特異性進(jìn)行檢測(cè)，構(gòu)建不同轉(zhuǎn)BMPR-IB基因重組真核表達(dá)載體，分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染山羊成纖維

3、細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，并利用quantitative RT-PCR和Westen Blot方法對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，研究結(jié)果如下:
　　1.克隆得到了包含編碼區(qū)A746G突變長(zhǎng)度為1550bp的BMPR-IB基因的完整編碼區(qū)（終止密碼子除外）序列，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接比對(duì)發(fā)現(xiàn)，除A746G突變外，克隆序列還存在編碼區(qū)C1470A突變，但該突變未引起編碼氨基酸的變化，為同義突變。
　　2.成功克隆了長(zhǎng)度為486bp的鼠源OSP-

4、2卵巢啟動(dòng)子片段，MatInspector program和TFSEARCH軟件分析表明，克隆片段除包含有類(lèi)似于TATA-box和CAAT-box等核心啟動(dòng)元件外，還含有潛在的SRY、IK1、ER、AP1、HSF、CdxA等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn);構(gòu)建重組質(zhì)粒pOSP-2-EGFP，經(jīng)LipofectamineTM3000介導(dǎo)進(jìn)行體外綿、山羊成纖維和顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染24h后，在綿、山羊顆粒細(xì)胞中均可觀察到呈微弱綠色熒光的細(xì)胞，表明EGF

5、P報(bào)告基因開(kāi)始表達(dá)，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，細(xì)胞亮度有所增加，而轉(zhuǎn)染不同品種和來(lái)源的成纖維細(xì)胞72h后始終未觀察到熒光，表明pOSP-2-EGFP能夠引導(dǎo)EGFP基因在綿、山羊顆粒細(xì)胞中特異表達(dá);流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞72h后的效率約為4％。
　　3.擴(kuò)增得到了長(zhǎng)度分別為1100bp和515bp的綿羊CYP19基因卵巢啟動(dòng)子片段，分別將其克隆到去除CMV啟動(dòng)子的pEGFP-N2載體骨架中，構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCYP19-1.1-E

6、GFP和pCYP19-0.5-EGFP;轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件分析表明，擴(kuò)增片段除含有類(lèi)似于TATA-box核心啟動(dòng)順式元件外，還含有多個(gè)潛在轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn);在脂質(zhì)體LipofectamineTMLTX+PLUS介導(dǎo)下，分別進(jìn)行綿羊的顆粒細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，結(jié)果轉(zhuǎn)染24 h后，在pCYP19-1.1-EGFP轉(zhuǎn)染組顆粒細(xì)胞中觀察到了綠色熒光的表達(dá)，轉(zhuǎn)染48 h后熒光細(xì)胞數(shù)量有所增加，轉(zhuǎn)染72 h時(shí)熒光細(xì)胞數(shù)最多，在胎兒成

7、纖維細(xì)胞中也觀察到了有少量EGFP基因的表達(dá)，表明擴(kuò)增所得的綿羊CYP19基因卵巢啟動(dòng)子1100bp片段可引導(dǎo)外源基因在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)，但缺乏高度專(zhuān)一性。而pCYP19-0.5-EGFP-轉(zhuǎn)染組，至轉(zhuǎn)染72h時(shí)，在顆粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中均未觀察到綠色熒光，表明克隆515bp片段無(wú)啟動(dòng)子活性。
　　4.構(gòu)建了重組表達(dá)載體pEGFP-BMPR-IB，經(jīng)脂質(zhì)體LipofectamineTMLTX+PLUS介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染7日齡羔羊耳組織成

8、纖維細(xì)胞和太行山羊胎兒成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48h和72h收集細(xì)胞，分別提取RNA和蛋白，利用quantitative RT-PCR和Westen Blot方法檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果表明pEGFP-BMPR-IB轉(zhuǎn)染組羔羊耳組織和胎兒成纖維細(xì)胞BMPR-IB基因在mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.01)，在蛋白水平的表達(dá)高于空白對(duì)照組(P＞0.05)，實(shí)現(xiàn)了BB突變型BMPR-IB基因在山羊成纖維細(xì)胞中的表達(dá);檢測(cè)表明

9、BMPR-IB基因在山羊成纖維細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)能上調(diào)IGE-Ⅰ和下調(diào)BMP4、GDF5、TLR4基因的表達(dá)。
　　5.成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體p-CYP19-EGFP-BMPR-IB，經(jīng)脂質(zhì)體LipofectamineTM3000介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染山羊顆粒細(xì)胞，并與轉(zhuǎn)染后48和72h收集細(xì)胞，分別提取RNA和蛋白，利用RT-PCR和Westen Blot方法對(duì)基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組顆粒細(xì)胞中BMPR-IB基因mRNA水平的相

10、對(duì)表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，蛋白水平的表達(dá)量高于對(duì)照組(P＞0.05)，成功實(shí)現(xiàn)了BB突變型BMPR-IB基因在山羊顆粒細(xì)胞中的表達(dá);BMPR-IB基因在山羊顆粒細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)能上調(diào)IGE-Ⅰ、GDF5和下調(diào)BMP4、TLR4基因的表達(dá)。
　　綜上，克隆得到了長(zhǎng)度為1550bp的BB型BMPR-IB基因的編碼區(qū)序列，并成功構(gòu)建了pEGFP-BMPR-IB和p-CYP19-EGFP-BMPR-IB重組表達(dá)載體，通過(guò)脂質(zhì)