BB型BMPr-IB基因的克隆及其在山羊成纖維和顆粒細胞中的表達研究.pdf

1、FecB基因是在澳大利亞Booroola羊中發(fā)現(xiàn)的一個與高繁殖率相關(guān)的主效基因，后續(xù)的研究證明FecB基因?qū)崬楣切螒B(tài)發(fā)生蛋白Ⅰ型受體基因（Bone MorphogeneticProtein Receptor-IB，BMPR-IB）。研究發(fā)現(xiàn)，Booroola綿羊BMPR-IB堿基序列上存在1個A746G突變，使其所編碼的第249位氨基酸由谷氨酰胺突變?yōu)榫彼?Q→R)，引起蛋白結(jié)構(gòu)的變化，使攜帶該突變基因母羊的顆粒細胞分化和卵泡成熟速度

2、加快，從而使排卵數(shù)增加。目前研究表明，該突變在世界各地綿羊品種中均有分布，且與產(chǎn)羔數(shù)密切相關(guān)。但對多個山羊品種及奶山羊品種BMPR-IB基因的多態(tài)性進行檢測，均未檢測到該突變。為在山羊細胞中引入BMPR-IB基因A746G突變，本研究從綿羊卵巢組織中克隆了BB型BMPR-IB基因全長編碼區(qū)（去除終止密碼）序列，擴增不同卵巢啟動子片段對其在卵丘顆粒細胞中的特異性進行檢測，構(gòu)建不同轉(zhuǎn)BMPR-IB基因重組真核表達載體，分別瞬時轉(zhuǎn)染山羊成纖維

3、細胞和顆粒細胞，并利用quantitative RT-PCR和Westen Blot方法對相關(guān)基因的表達進行了檢測，研究結(jié)果如下:
　　1.克隆得到了包含編碼區(qū)A746G突變長度為1550bp的BMPR-IB基因的完整編碼區(qū)（終止密碼子除外）序列，對測序結(jié)果進行拼接比對發(fā)現(xiàn)，除A746G突變外，克隆序列還存在編碼區(qū)C1470A突變，但該突變未引起編碼氨基酸的變化，為同義突變。
　　2.成功克隆了長度為486bp的鼠源OSP-

4、2卵巢啟動子片段，MatInspector program和TFSEARCH軟件分析表明，克隆片段除包含有類似于TATA-box和CAAT-box等核心啟動元件外，還含有潛在的SRY、IK1、ER、AP1、HSF、CdxA等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點;構(gòu)建重組質(zhì)粒pOSP-2-EGFP，經(jīng)LipofectamineTM3000介導進行體外綿、山羊成纖維和顆粒細胞轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染24h后，在綿、山羊顆粒細胞中均可觀察到呈微弱綠色熒光的細胞，表明EGF

5、P報告基因開始表達，隨著轉(zhuǎn)染時間的增加，細胞亮度有所增加，而轉(zhuǎn)染不同品種和來源的成纖維細胞72h后始終未觀察到熒光，表明pOSP-2-EGFP能夠引導EGFP基因在綿、山羊顆粒細胞中特異表達;流式細胞儀測定轉(zhuǎn)染顆粒細胞72h后的效率約為4％。
　　3.擴增得到了長度分別為1100bp和515bp的綿羊CYP19基因卵巢啟動子片段，分別將其克隆到去除CMV啟動子的pEGFP-N2載體骨架中，構(gòu)建了真核表達載體pCYP19-1.1-E

6、GFP和pCYP19-0.5-EGFP;轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測軟件分析表明，擴增片段除含有類似于TATA-box核心啟動順式元件外，還含有多個潛在轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點;在脂質(zhì)體LipofectamineTMLTX+PLUS介導下，分別進行綿羊的顆粒細胞和胎兒成纖維細胞轉(zhuǎn)染試驗，結(jié)果轉(zhuǎn)染24 h后，在pCYP19-1.1-EGFP轉(zhuǎn)染組顆粒細胞中觀察到了綠色熒光的表達，轉(zhuǎn)染48 h后熒光細胞數(shù)量有所增加，轉(zhuǎn)染72 h時熒光細胞數(shù)最多，在胎兒成

7、纖維細胞中也觀察到了有少量EGFP基因的表達，表明擴增所得的綿羊CYP19基因卵巢啟動子1100bp片段可引導外源基因在顆粒細胞中的表達，但缺乏高度專一性。而pCYP19-0.5-EGFP-轉(zhuǎn)染組，至轉(zhuǎn)染72h時，在顆粒細胞和成纖維細胞中均未觀察到綠色熒光，表明克隆515bp片段無啟動子活性。
　　4.構(gòu)建了重組表達載體pEGFP-BMPR-IB，經(jīng)脂質(zhì)體LipofectamineTMLTX+PLUS介導瞬時轉(zhuǎn)染7日齡羔羊耳組織成

8、纖維細胞和太行山羊胎兒成纖維細胞，轉(zhuǎn)染后48h和72h收集細胞，分別提取RNA和蛋白，利用quantitative RT-PCR和Westen Blot方法檢測相關(guān)基因的表達，結(jié)果表明pEGFP-BMPR-IB轉(zhuǎn)染組羔羊耳組織和胎兒成纖維細胞BMPR-IB基因在mRNA水平的相對表達量極顯著高于空白對照組(P＜0.01)，在蛋白水平的表達高于空白對照組(P＞0.05)，實現(xiàn)了BB突變型BMPR-IB基因在山羊成纖維細胞中的表達;檢測表明

9、BMPR-IB基因在山羊成纖維細胞中的過表達能上調(diào)IGE-Ⅰ和下調(diào)BMP4、GDF5、TLR4基因的表達。
　　5.成功構(gòu)建了重組表達載體p-CYP19-EGFP-BMPR-IB，經(jīng)脂質(zhì)體LipofectamineTM3000介導瞬時轉(zhuǎn)染山羊顆粒細胞，并與轉(zhuǎn)染后48和72h收集細胞，分別提取RNA和蛋白，利用RT-PCR和Westen Blot方法對基因表達情況進行檢測，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組顆粒細胞中BMPR-IB基因mRNA水平的相

10、對表達量極顯著高于對照組(P＜0.01)，蛋白水平的表達量高于對照組(P＞0.05)，成功實現(xiàn)了BB突變型BMPR-IB基因在山羊顆粒細胞中的表達;BMPR-IB基因在山羊顆粒細胞中的過表達能上調(diào)IGE-Ⅰ、GDF5和下調(diào)BMP4、TLR4基因的表達。
　　綜上，克隆得到了長度為1550bp的BB型BMPR-IB基因的編碼區(qū)序列，并成功構(gòu)建了pEGFP-BMPR-IB和p-CYP19-EGFP-BMPR-IB重組表達載體，通過脂質(zhì)