CAEV p28蛋白的原核表達(dá)及CAEV感染山羊卵巢顆粒細(xì)胞的研究.pdf

1、山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎(CaprineArthritisEncephalitis,CAE)是由反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CaprineArthritisEncephalitisVirus,CAEV)引起的山羊的慢性傳染病。CAE的典型癥狀是山羊羔腦脊髓炎和成年山羊多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、硬結(jié)性乳房炎以及間質(zhì)性肺炎。該病呈全球分布，英國(guó)、美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家更為嚴(yán)重，我國(guó)于1982年進(jìn)口種山羊時(shí)傳入本病，該病對(duì)山羊種群造成的經(jīng)濟(jì)損失是慘重的。但

2、是目前，對(duì)該病的預(yù)防與控制仍是世界各國(guó)所面臨的難題。為了在我國(guó)更好地預(yù)防和控制本病的發(fā)生和流行，建立一種快速、簡(jiǎn)單、可靠的檢測(cè)CAEV的診斷方法，本試驗(yàn)在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)了CAEVp28特異性蛋白，并用該蛋白作抗原建立了間接ELISA檢測(cè)方法，用該方法對(duì)100份本室保存血清進(jìn)行了檢測(cè)?！　∈紫仁褂蒙窖蜿P(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞成功繁殖了山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒后，參照GenBank發(fā)表的基因序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，對(duì)CAEV甘肅株p28

3、基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行了分子克隆，利用pET表達(dá)載體成功實(shí)現(xiàn)了p28基因在大腸桿菌中的表達(dá)。重組蛋白氨基端帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，利用固定化金屬離子親和層析法進(jìn)行純化，免疫印跡試驗(yàn)證明該重組蛋白具有良好的抗原性和特異性。以純化蛋白作為診斷抗原建立了間接ELISA診斷方法，確定其最佳工作條件為重組抗原每孔包被0.1μg，陽(yáng)性血清以1：50倍稀釋，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊IgG(HRP-兔抗山羊IgG)以1：1000倍稀釋，HRP-兔抗山

4、羊IgG最佳作用時(shí)間為2h，判定標(biāo)準(zhǔn)為P/N值大于2，且OD值在1.0左右的血清為陽(yáng)性，否則判為陰性；同時(shí)用純化的p28蛋白免疫小鼠，制備陽(yáng)性血清。利用重組蛋白抗原檢測(cè)3只CAEV攻毒后山羊血清抗體水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，3只山羊均在接種2周后可產(chǎn)生p28蛋白的相應(yīng)抗體，此抗體一直持續(xù)存在且滴度較高。在分別以p28蛋白做抗原的瓊脂糖免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)結(jié)果和間接ELISA試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比中發(fā)現(xiàn)，攻毒山羊在接種5周后用兩種方法都可檢測(cè)到血清抗體，但瓊

5、擴(kuò)方法檢測(cè)到抗體的最早時(shí)間比ELISA方法檢測(cè)到抗體的最早時(shí)間要遲3周，而且瓊擴(kuò)方法在檢測(cè)攻毒后第6個(gè)月山羊血清時(shí)為陰性，而ELISA方法檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，一方面說(shuō)明表達(dá)的p28蛋白抗原性好，另一方面也說(shuō)明用瓊擴(kuò)方法能夠檢測(cè)到的p28抗體水平要比ELISA方法能夠檢測(cè)到的p28抗體水平高，ELISA診斷方法比瓊擴(kuò)診斷方法有高的敏感性。重組抗原在實(shí)際應(yīng)用中共檢測(cè)100份血清樣品，67份抗體檢測(cè)呈陽(yáng)性。　　我們知道CAEV能夠在山羊關(guān)節(jié)滑膜

6、、胎肺、眼角膜細(xì)胞上繁殖，但最近國(guó)外有報(bào)道稱：CAEV在山羊卵巢顆粒細(xì)胞上也能夠繁殖，而且山羊卵巢顆粒細(xì)胞經(jīng)常被用于體外卵母細(xì)胞成熟，同時(shí)幾乎所有的工業(yè)化國(guó)家山羊種群都高度感染CAEV，而且許多不明來(lái)源的卵母細(xì)胞被用作體外山羊胚胎生產(chǎn)，所以我們認(rèn)為作為飼養(yǎng)層細(xì)胞的顆粒細(xì)胞可能是山羊胚胎感染CAEV的主要來(lái)源，因此，顆粒細(xì)胞能否被CAEV感染是我們確定山羊胚胎感染CAEV的途徑提供一條新的線索。為此，本研究進(jìn)行了CAEV在山羊卵巢顆粒細(xì)胞

7、上的感染性試驗(yàn)。對(duì)山羊卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，傳代2-3代以后，接種CAEV，觀察細(xì)胞病變，提取病變細(xì)胞核酸后，用設(shè)計(jì)好的的針對(duì)CAEVp28基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出一條660bp的片段，經(jīng)過(guò)序列分析后，確定為p28基因，證明CAEV基因組已整合到顆粒細(xì)胞基因組上；用上面試驗(yàn)中制備的p28蛋白免疫小鼠獲得的陽(yáng)性血清對(duì)病毒在顆粒細(xì)胞上的培養(yǎng)物進(jìn)行CAEV特異性蛋白的免疫印跡試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物中有CAEV特異性p28蛋白，證實(shí)整合到

8、顆粒細(xì)胞基因組上的CAEV能表達(dá)CAEV特異性蛋白；又用顆粒細(xì)胞上繁殖的CAEV在山羊關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞進(jìn)行病毒滴定，結(jié)果TCID50值為10-5/ml,顯示CAEV在山羊顆粒細(xì)胞上能夠繁殖，并釋放出病毒粒子?！　”驹囼?yàn)在國(guó)內(nèi)首次成功表達(dá)了CAEVp28基因并建立了針對(duì)該蛋白的間接ELISA的診斷方法。該診斷方法敏感、特異，為我國(guó)CAEV的診斷與監(jiān)測(cè)提供了一種技術(shù)手段，并為該診斷試劑盒的研制與開(kāi)發(fā)奠定了前期基礎(chǔ)。同時(shí)確定了起源于山羊卵泡的顆