CDC25C基因在成年山羊與幼年山羊卵巢顆粒細胞中的表達及功能驗證.pdf

1、卵泡顆粒細胞是卵泡的一種重要組成單位，環(huán)繞于卵母細胞周圍。隨著卵泡的發(fā)育，卵泡顆粒細胞會發(fā)生相應的變化，其增殖分泌的多種激素及生長因子與卵母細胞的生長和成熟有著極為重要的作用。
　　本研究前期發(fā)現(xiàn)，幼齡母羊與成年母羊的卵母細胞在體外成熟過程中，成熟率有著顯著性差異，并且幼齡母羊的卵母細胞經(jīng)體外成熟受精后發(fā)育至四細胞的比例也顯著性低于成年母羊。試驗中發(fā)現(xiàn)，幼齡母羊與成年母羊的卵泡顆粒細胞有著很大的不同點，無論是數(shù)量，還是環(huán)繞卵母細胞

2、的形態(tài)。
　　另一個發(fā)現(xiàn)就是細胞分裂周期蛋白25同源蛋白C基因在幼齡母羊卵母細胞與成年母羊卵母細胞中的表達有顯著性差異，這個基因具有調控細胞分裂周期作用，可調節(jié)真核生物細胞有絲分裂，是細胞周期進入M期的關鍵因子之一。
　　綜合上述兩種發(fā)現(xiàn)，本實驗決定從卵泡顆粒細胞的角度驗證CDC25C基因功能，嘗試解開不同年齡階段卵母細胞成熟率差異的原因。本實驗以江蘇南通當?shù)匕咨窖驗檠芯繉ο?，采?.5年齡以上的成年母羊與2月齡羔羊的卵巢并

3、使用0.01M PBS帶回實驗室。體外分離卵泡顆粒細胞經(jīng)培養(yǎng)轉染后，對成年母羊與羔羊的卵泡顆粒細胞進行了CDC25C、CDK1、WEE1相關基因，雌激素和孕激素，轉染后細胞周期等相關檢測，結果如下:
　　1.山羊CDC25C基因的克隆
　　根據(jù)NCBI提供的CDC25C基因序列，設計引物克隆CDC25C基因的CDS區(qū)，隨后構建該基因的pCMV-HA-CDC25C載體和小分子干擾載體siCDC25C。測序結果表明pCMV-HA

4、-CDC25C載體構建正確，與此同時小分子干擾載體siCDC25C在預實驗中被證實有效，皆可用于后續(xù)試驗。
　　2.原代分離細胞的鑒定
　　依據(jù)酶聯(lián)免疫原理，山羊卵泡顆粒細胞表面擁有特異性FSH受體，試驗采用RabbitAnti-FSHR多克隆抗體作為一抗，SA1074-兔IgG為二抗，經(jīng)過酶聯(lián)免疫檢測后認定，本實驗分離的細胞絕大部分都是所需要的卵泡顆粒細胞，可繼續(xù)后續(xù)試驗。
　　3.CDC25C基因對卵泡顆粒細胞的影

5、響
　　構建pCMV-HA-CDC25C載體和小分子干擾載體siCDC25C，轉染成年山羊和幼齡山羊卵泡顆粒細胞后，利用實時熒光定量PCR技術對CDC25C、CDK1、WEE1基因的相對表達量進行檢測，利用酶聯(lián)免疫方式檢測了PROG和E2兩種激素分泌情況，利用切片技術比較了成年山羊與幼齡山羊卵巢的區(qū)別，利用細胞周期檢測技術比較了兩種山羊卵泡顆粒細胞轉染重組載體和干擾載體后的細胞周期區(qū)別。
　　(1)轉染pCMV-HA-CDC

6、25C載體后，成年山羊的卵泡顆粒細胞的CDC25C、CDK1、WEE1基因的相對表達量都得到了顯著性提升;PROG和E2兩種激素的分泌量也有所上升，且與空白組比較差異顯著;成年山羊卵巢上的卵泡較少，但發(fā)育程度更好;細胞中分裂期占間期的比例得到顯著性上升。轉染pCMV-HA-CDC25C載體后，幼齡山羊的卵泡顆粒細胞的CDC25C基因的相對表達量得到上升，但是CDK1、WEE1基因的相對表達量卻出現(xiàn)了下降;PROG和E2兩種激素的分泌量也

7、有所上升;幼齡山羊卵巢上的卵泡更多，但發(fā)育程度不好;細胞中分裂期占間期的比例得到顯著性上升。
　　(2)轉染小分子干擾載體siCDC25C后，成年山羊的卵泡顆粒細胞的CDC25C、CDK1、WEE1基因的相對表達量都有所下降;PROG和E2兩種激素的分泌量有一定上升;細胞中分裂期占間期的比例有顯著性下降。幼齡山羊的卵泡顆粒細胞的CDC25C、CDK1、WEE1基因的相對表達量均有所下降;PROG和E2兩種激素的分泌量有一定上升;細