IL-1受體抗拮劑預防炎性細胞因子介導的大鼠胰島無功能的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 胰島細胞分離、純化的結果是胰島移植成功的關鍵因素。胰島的數(shù)量和質量的缺失取決于一些復合因素,包括胰島分離過程中的應激和肝中移植部位的微環(huán)境等。胰島移植到肝臟后,非特異性炎癥物質級聯(lián)反應將被啟動,包括血凝途徑激活和巨噬細胞和內皮細胞釋放促炎癥反應細胞因子(PIC)。我們假定完全阻斷IL-1β和其細胞受體的結合能夠在PIC引發(fā)分離的胰島凋亡和壞死方面為胰島提供更完全的保護。我們研究大鼠胰島培養(yǎng)模型加PIC,以闡明胰島損

2、傷機制且測定阻斷IL-1受體拮抗劑(IL-1ra)能否為損傷提供保護。
　　 材料與方法
　　 一、材料
　　 實驗動物、主要設備、藥品和試劑
　　 普通級封閉群wistar大鼠,雌雄,體重250-280g。鼠顯微手術器械,超凈手術臺,0.22um除菌濾器,電熱恒溫水浴箱(DHW-600),多功能振蕩器,電子天平,微量加樣器,熒光倒置顯微鏡(Olympus),高速離心機(TDL-5A),CO2細胞培養(yǎng)箱(

3、Thermo)；全自動化化學發(fā)光免疫分析儀(美國雅培AXSYM)。膠原酶V型,Hank’s液,Ficoll-400,雙硫腙(,DTZ),丫啶橙(AO),溴乙啶(EB)；RPMI-1640培養(yǎng)液,TNF-),IL-1ra,IL-1β； NO和一氧化氮合酶(iNOS)檢測試劑盒。IFN-γ。
　　 二、方法
　　 (一)大鼠胰島的分離和純化。
　　 1、采用明尼蘇達大學改良法分離、純化大鼠胰島。膠原酶V原位灌注胰腺,

4、快速切取,水浴消化。再經80目不銹鋼篩網過濾、離心。然后采用Ficoll不連續(xù)密度梯度離心純化胰島。
　　 (二)胰島培養(yǎng)及分組
　　 新鮮分離純化的胰島RPMI-1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)條件為:37℃,5％二氧化碳,95％空氣。根據實驗條件隨機分為四組:A組(空白對照組)；B組(細胞因子組)；C組(IL-1ra組)；D組:(IL-1ra+細胞因子組).
　　 三、觀察指標
　　 體外葡萄糖刺

5、激下胰島素釋放試驗。丫啶橙/嗅乙啶(AO/EB)熒光染色法顯示胰島細胞活率。檢測胰島培養(yǎng)液中NO胰島組織中iNOS水平。
　　 四、統(tǒng)計學分析
　　 數(shù)據以(x)±s表示,使用方差分析和t檢驗,SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,P<0.05為有統(tǒng)計學差異。
　　 結果
　　 一、胰島功能檢測
　　 胰島素釋放實驗的結果顯示,A組的胰島經過24h培養(yǎng)后,胰島素分泌水平較高,胰島功能良好。B組

6、胰島功能嚴重受損,胰島素分泌量和胰島素釋放指數(shù)(SI)均明顯下降(P<0.01):D組胰島素分泌量和SI均較B組明顯升高(P<0.01)。C組胰島在培養(yǎng)液中單純加入IL-1ra后,胰島素分泌及SI有所升高,但是沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；
　　 二、胰島活性鑒定
　　 A組和C組胰島經AO/EB染色后,倒置顯微鏡下可見大多數(shù)胰島發(fā)出綠色熒光,提示胰島存活良好。而B組的胰島染色見大多數(shù)胰島發(fā)出黃色熒光,提示胰島存活不良

7、,大量死亡。D組胰島大多數(shù)仍保持完整外形,發(fā)出綠色熒光,存活情況明顯好于B組。
　　 三、胰島培養(yǎng)液中NO水平和胰島組織中iNOS活性
　　 A組胰島培養(yǎng)24h后,培養(yǎng)液中NO濃度及胰島組織iNOS活性均比較低。
　　 B組胰培養(yǎng)液中NO濃度和胰島組織iNOS活性都較A組明顯升高(P<0.01),尤其是iNOS活性超過A組10倍以上； D組胰島組織的iNOS活性較B組受到顯著抑制,NO水平也大大降低(P<0.01

8、),與A組基本在同一水平,差別沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)； C組胰島iNOS活性及培養(yǎng)液NO濃度雖低于A組和D組,但差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 結論
　　 一.在IL-1β、TNF-α、IFN-γ等細胞因子的刺激下,胰島組織中誘導型一氧化氮合酶(iNOS)可大量表達,催化合成的高濃度NO是β細胞損傷的效應因子。
　　 二.IL-1ra對胰島保護作用的機制可能在于,阻止IL-1β等pic與相關的