IL-1β和IFNγ介導(dǎo)胰島INS-1E細胞凋亡的機制.pdf

1、目的:
　　研究炎性因子IL-1β、IFNγ聯(lián)合介導(dǎo)胰島β細胞系INS-1E細胞產(chǎn)生凋亡的機制。
　　方法:
　　1、收集臨床Ⅱ型糖尿病人和正常人的血清并記錄基本資料,用ELISA試劑盒分別檢測糖尿病組和正常組血清中IL-1β和IFNγ的含量并進行組間比較;
　　2、將INS-1E細胞分為對照組和凋亡組,對照組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時,凋亡組用濃度為100U/ml IL-1β、1000U/ml IFNγ的炎性因子

2、培養(yǎng)基刺激48小時。MTS檢測兩組細胞的活力并進行組間比較;光學(xué)顯微鏡觀察兩組細胞形態(tài)的變化;houchest33253對兩組細胞的細胞核進行染色并用熒光顯微鏡觀察兩組細胞細胞核的變化;免疫熒光染色法對兩組細胞中 Bax以及線粒體進行標(biāo)識,并用熒光顯微鏡觀察Bax在細胞中與線粒體位置關(guān)系的變化;Western blot檢測兩組細胞中蛋白質(zhì)磷酸化水平、蛋白表達量的變化并進行組間比較;將無意義質(zhì)粒、TCTP過表達質(zhì)粒、shRNA阻斷質(zhì)粒分別

3、包被在腺病毒中侵染INS-1E細胞,侵染48小時后得到空載體組、TCTP過表達組、TCTP阻斷組三組細胞,用熒光顯微鏡觀察自帶綠色熒光的質(zhì)粒在三組細胞中的表達效率;Western blot檢測三組細胞蛋白中TCTP表達量的變化;用濃度為100U/ml IL-1β、1000U/ml IFNγ的炎性因子培養(yǎng)基分別作用于三組細胞,作用時間為48小時,MTS檢測三組細胞的活力,用TCTP過表達組和TCTP阻斷組的細胞活力分別與空載體組的細胞活力

4、進行比較。
　　結(jié)果:
　　1、ELISA檢測糖尿病組與正常組血清的IL-1β與IFNγ的含量:結(jié)果顯示糖尿病組血清中IFNγ的濃度為0.29 ng/L,與正常組(0.08 ng/L)之間的差異有顯著性意義(P<0.01);糖尿病組IL-1β的濃度為0.38 ng/L,與正常組(0.12 ng/L)之間的差異也有顯著性意義(P<0.01)。
　　2、MTS檢測結(jié)果證實凋亡組細胞活力(0.28)與對照組(0.68)之間差

5、異有顯著性意義(P<0.01);
　　3、光鏡下凋亡組細胞形態(tài)發(fā)生皺縮而對照組細胞形態(tài)良好;熒光顯微鏡下houchest33258標(biāo)識的凋亡組INS-1E細胞核出現(xiàn)核濃縮、核碎裂等典型的凋亡形態(tài)改變,而對照組細胞核形態(tài)正常;對照組線粒體和 Bax都均散在分布于細胞質(zhì)中,而凋亡組中線粒體出現(xiàn)聚集同時 Bax向線粒體遷移并與線粒體形成共定位;
　　4、Western blot檢測凋亡組的細胞蛋白并與對照組進行比較發(fā)現(xiàn)凋亡組中TC

6、TP的表達量降低,P53和 cleaved caspase-3的表達量升高;凋亡組中 Bcl-2家族內(nèi)具有拮抗凋亡作用的Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1表達量降低;Bcl-2家族內(nèi)具有促進凋亡作用的Bax和Bad蛋白表達量變化不明顯;凋亡組中反映細胞增殖活力的激酶AKT活性降低;
　　5、熒光顯微鏡下三組細胞內(nèi)的綠色熒光質(zhì)粒均大量表達;過表達組 TCTP水平升高,阻斷組TCTP水平降低; MTS檢測結(jié)果顯示TCTP過表達組的細