TLR4-NF-κB及其炎性因子IL-1β在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷中的表達(dá).pdf

1、背景與目的:
　　創(chuàng)傷性腦損傷（Traumatic brain injury，TBI)是世界上造成人類高死亡率和高致殘率的重要因素之一，尤其是在兒童和年輕人中，給家庭和整個(gè)社會(huì)帶來了嚴(yán)重的心理問題和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。TBI是一種由于外部機(jī)械力對(duì)大腦造成的損害，腦外傷幸存者可遺留下短暫或永久的認(rèn)知功能障礙及其他生理功能的損傷，并產(chǎn)生一系列的心理疾病。它是由原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷共同作用的高度復(fù)雜的疾病。
　　大量研究結(jié)果表明，創(chuàng)傷性腦

2、損傷后的繼發(fā)性損傷，是在原發(fā)性損傷造成傷害的基礎(chǔ)上對(duì)機(jī)體造成了進(jìn)一步的損傷，決定著腦損傷病人的預(yù)后和結(jié)果。而由于繼發(fā)性損傷具有一定的延遲性，也可為防止組織的進(jìn)一步損傷及改善損傷后的功能恢復(fù)提供一個(gè)治療的時(shí)間窗。眾多的臨床和實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，創(chuàng)傷性腦損傷在大腦引起的炎癥和免疫反應(yīng)在創(chuàng)傷性腦損傷后的繼發(fā)性腦損傷中扮演著關(guān)鍵角色。其中，Toll樣受體家族（toll like receptors, TLRs）所介導(dǎo)的信號(hào)通路在腦損傷過程中尤其重

3、要，Toll樣受體家族中的TLR4在TBI后啟動(dòng)炎癥反應(yīng)中起著重要的作用。
　　TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要是激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3來調(diào)節(jié)相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄和髓樣分化因子88銜接蛋白依賴性途徑，通過與髓樣分化因子88銜接蛋白的相互作用激活下游核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factorκB, NF-κB），并引起促炎細(xì)胞因子和神經(jīng)毒性的后續(xù)生產(chǎn)。TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還可以通過髓樣分化因子88的激活和相應(yīng)的下游效應(yīng)因子使NF-κB的抑制因子IκB

4、磷酸化，從而使NF-κB活化，啟動(dòng)相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄。NF-κB是最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，具有多向性轉(zhuǎn)錄激活功能，參與了炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等許多生理病理過程。當(dāng)組織細(xì)胞受到外界病理性刺激，TLR4通過信號(hào)傳遞激活NF-κB并使其發(fā)生移位，從而導(dǎo)致TLR4／NF-κB信號(hào)通路下游的許多炎性因子如IL-1β、MCP-1、IL-6、TNF-α、趨化因子等的分泌。我們復(fù)制了經(jīng)典feeney’s自由落體損傷模型，并利用該模型觀察腦損傷后大鼠腦

5、組織的病理變化，檢測TLR4／NF-κB及其炎性因子IL-1β在創(chuàng)傷性腦損傷中不同時(shí)間表達(dá)的變化規(guī)律，進(jìn)一步闡明三者在腦挫裂傷后病理生理變化的作用，為臨床治療和法醫(yī)鑒定提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　成年健康清潔級(jí)SD(Sprague-Dawley)大鼠72只，雌雄不限，體重250-300g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有動(dòng)物隨機(jī)分為兩組：假手術(shù)組12只（免疫組化組和RT-PCR組各6只）僅做常規(guī)麻醉開顱，不做顱腦打擊；腦

6、損傷組60只，仿制經(jīng)典feeney’s自由落體損傷模型后分別于第3h、6h、12h、1d、3d和7d各隨機(jī)選取10只，進(jìn)行大鼠腦損傷后的行為學(xué)觀察，并對(duì)損傷組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分后隨機(jī)分為兩組，分別用免疫組化和RT-PCR技術(shù)檢測TLR4、NF-κB及其介導(dǎo)炎性因子IL-1β的表達(dá)。RT-PCR組開顱取腦后，無菌操作下立即取出腦組織置于冰上，觀察損傷部位的出血面積，剪取損傷灶周圍組織約200g用于腦組織含水量的測定，另外剪取損傷灶周

7、圍腦組織約50g，放入凍存管，編號(hào)后迅速置于液氮罐中保存，適時(shí)提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后行RT-PCR檢測TLR4 mRNA、NF-κB mRNA及其介導(dǎo)炎性因子IL-1βmRNA的表達(dá)。免疫組化組開顱取腦后迅速用4％多聚甲醛液固定24h后常規(guī)石蠟包埋切片，利用常規(guī)HE染色觀察大鼠皮層及海馬的形態(tài)學(xué)變化，并用SP法免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測TLR4、NF-κB及其介導(dǎo)炎性因子IL-1β的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、大鼠腦損傷后的行為學(xué)

8、觀察及大鼠顱腦損傷模型結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)顱腦損傷模型共使用SD大鼠60只，其中1只因麻醉意外死亡，2只因打擊后出現(xiàn)了呼吸心跳停止而死亡。大鼠在受打擊后出現(xiàn)了短暫的昏迷，自主呼吸及心率發(fā)生改變，有不同程度的肢體抽搐現(xiàn)象。打擊后所有標(biāo)本損傷處均有硬腦膜下血腫的表現(xiàn)，同時(shí)在大鼠顱腦損傷1h后根據(jù)Stahel P F等人簡化后的神經(jīng)功能損傷評(píng)分對(duì)損傷組大鼠對(duì)神經(jīng)功能損傷進(jìn)行評(píng)分，各組大鼠損傷1h后的評(píng)分并無明顯差別（p<0.05）。
　　2、腦

9、組織含水量的變化：損傷后腦組織可見輕度水腫，其表面顏色不均勻，腦組織含水量在傷后3h可見增加，并呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，24h達(dá)到高峰，此后開始降低，于7d時(shí)仍高于正常水平。
　　3、HE染色結(jié)果：損傷組大鼠腦組織的病理變化符合TBI形態(tài)特征。鏡下可見神經(jīng)元胞體明顯腫脹，結(jié)構(gòu)不清，核固縮，呈不規(guī)則形狀，細(xì)胞周圍出現(xiàn)間隙水腫，細(xì)胞核變性。
　　4、腦損傷組TLR4的表達(dá)在3h已經(jīng)開始增高，6h至12h持續(xù)增高（P<0.05），24

10、h達(dá)到高峰，3d至7d開始下降，但也明顯高于假手術(shù)組（P<0.05）。
　　5、腦損傷組NF-κB表達(dá)顯著增加，傷后3h后NF-κB活性開始增高（P<0.05），傷后24hNF-κB表達(dá)細(xì)胞數(shù)量顯著增加，達(dá)到高峰，3d至7d逐漸下降，但仍明顯高于對(duì)照組的表達(dá)量（P<0.05）。
　　6、腦損傷組炎性因子IL-1β的表達(dá)在早期迅速增高（P<0.05），于24h達(dá)到高峰（P<0.05），3d至7d后開始降低，但仍明顯高于對(duì)照組（

11、P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、大鼠腦損傷后TLR4／NF-κB及其炎性因子 IL-1β在腦組織中的表達(dá)呈逐漸升高趨勢，并在24h達(dá)到高峰，之后逐漸下降，呈現(xiàn)出一定的時(shí)序性。
　　2、調(diào)控TLR4／NF-κB關(guān)鍵環(huán)節(jié)，降低TLR4、NF-κB的表達(dá)或者活性，是防治腦損傷傷后炎癥反應(yīng)的一種方法。
　　3、大鼠腦損傷后TLR4／NF-κB及其炎性因子 IL-1β在腦組織中不同時(shí)間表達(dá)量的變化可作為法醫(yī)鑒定中的理