UVB誘導MEF細胞miR-365-465的表達及其信號通路的初步研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 太陽輻射中的紫外線根據波長可分為長波紫外線(UVA 320-400nm)、中波紫外線(UVB 280-320nm)和短波紫外線(UVC 100-280nm)。臭氧層能有效吸收全部的UVC和約95％的UVB,UVA則不能被吸收。雖然到達地面的UVB相對于UVA只占很小的比例,但由于皮膚中大多數的生物分子都是UVB輻射的吸收劑,如核酸、芳香族氨基酸等,因此,此波段的紫外線生物學效應最強,長期大劑量照射可引起皮

2、膚癌。
　　 作為腫瘤抑制基因的核轉錄因子,p53基因參與了細胞增殖、細胞凋亡、DNA修復及血管發(fā)生等一系列生物過程,是迄今發(fā)現的與人類腫瘤關系最為密切的抑痛基因,幾乎所有的人類腫瘤中均存在p53信號通路的異常。UVB誘導的皮膚腫瘤的發(fā)生也是一個復雜的連續(xù)過程,包括一系列基因如原癌基因、抑癌基因的遺傳改變,其中,UVB誘導的腫痛抑制基因p53的突變被認為是一個較早期的步驟。
　　 MicroRNA(miRNA)是一種非編

3、碼的內源性小RNA,長約22個核苷酸,可以通過與靶mRNA的互補配對而在轉錄后水平對基因的表達進行負調控,導致mRNA的降解或翻譯抑制,在細胞的增殖、分化、凋亡等過程中具有重要的調節(jié)作用。在p53基因活化通路中,多種miRNA成為其活化后下調某些蛋白表達的重要中間分子,miRNA家族成員廣泛參與了p53基因信號通路的調控,如miR-34家族、miR-29家族、miR-192和miR-215等。是否還有其他的miRNA分子也受p53基因的

4、調控,或者調控p53信號通路的其他分子呢?
　　 在生長抑制的人成纖維細胞WI-38中,存在miR-365的明顯下調,在對細胞增殖進行負調控的信號通路中,發(fā)現其上游調節(jié)因子包括衰老相關的miRNA,而腫瘤抑制基因p53則是此通路的中心。我們前期的研究工作證實,UVB輻射能顯著改變NIH3T3細胞中miRNA的表達特性,多種miRNA在不同時間點出現高表達,特別是miR-365在UVB照射后6h的表達升高近7倍,而miR-465在

5、每個時間點的表達都顯著下調。但與UVB誘導的miR-365/465表達變化相關的信號通路還未有報道。因此,進一步探討UVB輻射對miR-365/465表達變化的影響以及腫瘤抑制基因p53可能在UVB誘導的miR-365/465表達變化中的作用,深入認識miR-365/465的功能及其在基因表達調控網絡中的作用,尋找其下游靶基因仍有待研究。
　　 資料和方法
　　 野生型小鼠胚胎成纖維細胞(p53+/+細胞)購自美國典型培

6、養(yǎng)物收藏所(American Type Culture Collection,ATCC),p53缺失小鼠胚胎成纖維細胞(p53-/-細胞)由南方醫(yī)科大學病理生理學系惠贈。我們用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和蛋白質印跡法(Western Blot)對p53+/+和p53-/-這兩利,細胞進行了驗證；用實時熒光定量PCR方法(real-time quantitative PCR)檢測了UVB照射后p53+/+和p53-/-細胞中m

7、iR-365/465的表達,miRNA的變化以三個復孔的Ct值均值通過ΔCt法進行計算；利用miRBase、PicTar和TargetScan三個經典靶基因預測數據庫對miR-365/465的靶基因進行預測,并用生物信息學方法對靶基因進行了初步的基因功能分析。
　　 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數據分析,計量資料數據采用均數±標準差(X±s)表示。熒光定量PCR細胞ΔCt值的比較采用2-△△Ct法計算,改變達到2倍以上為差

8、異有顯著意義。
　　 結果
　　 1 經50J/m2UVB照射后,miR-365的表達下調,p53+/+細胞在照后4h、6h和24h的表達較對照組分別降低了2.5倍、2倍和2倍,差異有顯著性；p53-/-細胞在照后2h、4h和6h的表達較對照組分別降低了2.5倍、3倍和2倍,改變具有顯著意義。
　　 2 經50J/m2UVB照射后,p53+/+細胞中miR-465的表達下調,在照后各時間點其降低都超過2倍；p53

9、-/-細胞中miR-465的表達上調,在照后2h、4h、6h和12h升高均超過2倍,差異有顯著意義。
　　 3 經50J/m2UVB照射后,在對應的時間點,p53-/-細胞中miR-365的表達低于p53+/+細胞,其中對應的2h和4h的差別都超過了2倍；p53-/-細胞巾miR-465的表達顯著高于p53+/+細胞,差異均具有顯著意義。
　　 4 利用miRBase、Pictar和TargetScan三個經典靶基因預測

10、數據庫對miR-365/465的靶基因進行預測,3個數據庫預測的miR-365的靶基因取交集后得到32個靶基因,該32個靶基因的生物學功能主要集中在細胞增殖/分化、轉錄因子活性、細胞增殖的負向調控、細胞增殖的正向調控和氧化應激反應等方面；miR-465的靶基因3個數據庫取交集后得到29個靶基因,該29個靶基因的生物學功能主要包括細胞增殖/分化、轉錄的正向調控、蛋白質磷酸化、受體信號蛋白活性以及GTP酶ARF激活物活性等。
　　

11、結論
　　 1 miR-365在UVB照射后表達降低,且具有時間依賴性；p53基因對UVB誘導的miR-365的表達具有正向調節(jié)作用,此作用在UVB照射后的早期(4h)最為明顯。
　　 2 miR-465在LJVB照射后的p53+/+細胞中的表達降低,在UVB照射后的p53-/-細胞中表達升高；p53基因對UVB照射后miR-465的表達具有負向調節(jié)作用,且此調節(jié)作用較持久(達24h)。
　　 3 生物信息學的分