粉防己堿誘導腫瘤細胞周期阻滯和細胞凋亡的分子機制及其信號傳導通路研究.pdf

1、粉防己堿(TET)是從中草藥粉防己的根塊中提取的雙芐基異喹啉類生物堿。TET具有廣泛的藥理學作用，如抗風濕、抗炎和抗高血壓等。TET還具有抗腫瘤活性，可顯著性增強腫瘤細胞的放療和化療敏感性。已有研究表明TET誘導腫瘤細胞周期阻滯和細胞凋亡，但其作用機制到目前為止還不完全清楚。本研究的目的是闡明TET誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡的分子機制及信號調(diào)節(jié)通路，從而為TET的臨床應用提供更深入的理論依據(jù)和治療方案。 1.TET抑制結(jié)腸癌細胞

2、生長并誘導G1期阻滯和細胞凋亡。(1)HT-29細胞以不同濃度TET分別作用不同時間，生長抑制實驗和細胞活力檢測結(jié)果表明TET抑制腫瘤細胞生長，且呈濃度依賴性和時間依賴性。HCT116細胞以不同濃度TET作用18h，TET可明顯抑制細胞的生長，并呈濃度依賴性。(2)30μM TET作用HT-29細胞12h，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變?nèi)缂毎冃∽儓A，一些細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來；24h出現(xiàn)核固縮和凋亡小體等明顯凋亡征象。30μM TET作用HC

3、T116細胞12h也出現(xiàn)變小變圓的類似改變。(3)細胞周期分析結(jié)果顯示，TET(10-30μM)可將HT-29和HCT116細胞周期阻滯在G1期。30μM TET作用24h后，可出現(xiàn)明顯的sub-G1凋亡峰。 2.TET對PI3K/AKT/GSK3β通路的作用。(1)Western blot結(jié)果顯示，TET導致細胞周期阻滯及凋亡的作用與TET誘導細胞周期和凋亡調(diào)節(jié)蛋白的變化有關(guān)，它可以降低AKT、磷酸化AKT(Ser473)、c

4、yclinD1、procaspase 3、磷酸化GSK3β(Ser9)的表達，同時增加GSK3β、磷酸化cyclin D1(Thr286)的表達，誘導caspase 3的活化和PARP的裂解。(2)TET可增加HT-29細胞p27kip1的表達，并呈濃度和時間依賴性，這可能與TET誘導的G1期阻滯和凋亡有關(guān)。(3)由于TET可降低結(jié)腸癌細胞中cyclm D1的蛋白水平，因此我們對cyclin D1表達降低的機制進行了更深一步的研究。我們

5、發(fā)現(xiàn)蛋白酶抑制劑MG132(5μM)可以逆轉(zhuǎn)TET引起的cyclin D1蛋白的降低，這說明在結(jié)腸癌細胞中TET在蛋白水平促進cyclin D1的水解。(4)有研究報道GSK3β的胞核內(nèi)定位與其活化有關(guān)，因此我們通過間接免疫熒光染色法檢測了TET是否對GSK3β的細胞內(nèi)分布有影響。結(jié)果顯示30μM　TET作用12h，HT-29細胞中的GSK3β在細胞質(zhì)和細胞核中都有分布，而在對照細胞中，GSK3β只在細胞質(zhì)中表達，說明TET促使GSK3

6、β由胞質(zhì)向胞核移位。(5)為了進一步分析TET引起的AKT抑制與GSK3β活化的關(guān)系及AKT抑制與GSK3β活化對細胞周期和細胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白的影響，我們給予AKT抑制劑wortmannin和LY294002或者轉(zhuǎn)染外源性野生型GSK3β質(zhì)粒，觀察這兩種處理對HT-29細胞的作用及周期阻滯和凋亡相關(guān)蛋白表達變化。結(jié)果顯示AKT抑制劑降低了GSK3βSer9位磷酸化水平，表明AKT是GSK3β的上游(AKT抑制可引起GSK3β活化)。Wor

7、tmannin也下調(diào)cyclinD1并誘導caspase 3的活化和PARP的裂解。同樣地，轉(zhuǎn)染外源性GSK3β也增加cyclin D1(Thr286)磷酸化水平，下調(diào)cyclinD1并誘導了PARP的裂解。(6)為確定GSK3β活化在TET誘導G1期阻滯和細胞凋亡中的作用，我們應用了GSK3β抑制劑LiCl(30mM)和SB216763(30μM)以及RNA干擾劑GSK3βsiRNA。LiCl、SB216763和GSK3β siRNA

8、都減弱了TET所致G1期阻滯和細胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白的變化，即抑制cyclinD1下調(diào)、caspase3的活化和PARP的裂解。細胞周期分析和細胞凋亡檢測進一步確定了GSK3β活化在TET誘導G1期阻滯和細胞凋亡的作用。30μM TET作用18h后G1期細胞的百分比增加，而S期和G2/M期比例相應下降，同時出現(xiàn)了小的亞G1期(sub-G1)凋亡峰和少量壞死細胞。同時給予LiCl、SB216763或轉(zhuǎn)染GSK3β siRNA可抑制TET單獨作用

9、所致的G1期阻滯。Annexin-V/PI雙染和TUNEL，熒光染色結(jié)果表明GSK3β siRNA可逆轉(zhuǎn)TET所致的細胞凋亡。而且，轉(zhuǎn)染外源性野生型GSK3β質(zhì)粒同樣導致G1期阻滯和亞G1期出現(xiàn)，說明GSK3β活化足以導致細胞G1期阻滯和細胞凋亡。(7)為了解GSK3β下游caspase 3的活化在TET誘導細胞凋亡中的作用，我們運用了一種caspase3抑制劑Ac-DEVD-CHO。蛋白電泳表明Ac-DEVD-CHO可阻斷caspas

10、e 3的活化和PARP的裂解。Annoxin-V/PI染色表明Ac-DEVD-CHO可逆轉(zhuǎn)TET所致的細胞凋亡，表明TET可通過激活caspase 3誘導細胞凋亡。 3.TET對MAPK通路的影響為研究MAPK通路與TET作用的關(guān)系，我們也檢測了30μM TET分別作用不同時間引起MAPK表達變化。在HT-29細胞中，Western blot結(jié)果顯示磷酸化(活化)的JNK和p38的表達隨時間增加逐漸增強，但磷酸化(活化)的ERK

11、1/2表達降低；同樣在HCT116細胞中我們也發(fā)現(xiàn)TET增加磷酸化JNK和p38的表達，但磷酸化ERK1/2的表達下降，說明在這兩種細胞中TET激活了JNK和p38但抑制ERK1/2，可能參與TET誘導的周期阻滯及細胞凋亡。 4.TET對其他相關(guān)蛋白的影響我們還分析TET對其他相關(guān)蛋白如EGFR、NF-κB、mdm2和sutvivin的影響。我們發(fā)現(xiàn)TET可誘導這些蛋白的下調(diào)。 5.TET對蛋白酶體通路的影響為了解蛋白酶

12、體與TET作用的關(guān)系，我們使用蛋白酶體抑制劑MG132，發(fā)現(xiàn)預先給予MG132可逆轉(zhuǎn)TET單獨作用所致的G1阻滯。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)TET可促進蛋白酶體通路酶E1、E2、E3的mRNA表達上調(diào)。 結(jié)論：綜上所述，我們的研究證明有多種信號通路參與了TET誘導的細胞G1期阻滯和細胞凋亡的調(diào)節(jié)。(1)PI3K/AKT/GSK3β信號通路與TET誘導G1期阻滯和細胞凋亡有關(guān)，GSK3β活化在這些過程中起重要作用；(2)TET誘導的G1