miR-340調(diào)控UVB誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞樹突形成的機(jī)制研究.pdf

1、人體皮膚的顏色主要受色素沉著過程的影響,色素沉著過程也就是黑素代謝的生理過程,包括黑素合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、再分布和降解。在多種外界環(huán)境因素和生理因素影響下,機(jī)體形成一個(gè)復(fù)雜而有序的色素沉著調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[1]。色素沉著異常在臨床上表現(xiàn)為多種色素障礙性皮膚病,發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。
　　黑素轉(zhuǎn)運(yùn)是色素沉著過程中最為關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié),黑素合成后,必須由黑素細(xì)胞進(jìn)入角質(zhì)形成細(xì)胞,才能形成皮膚顏色并保護(hù)機(jī)體免受紫外線輻射損傷。黑素轉(zhuǎn)運(yùn)主要分為①細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)

2、:黑素細(xì)胞內(nèi)合成的黑素小體由核周向樹突末端運(yùn)動(dòng);②細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn):運(yùn)動(dòng)至樹突末端的黑素小體分泌進(jìn)入周圍角質(zhì)形成細(xì)胞。樹突是黑素細(xì)胞的特征性結(jié)構(gòu),作為黑素小體的運(yùn)動(dòng)管道和連接黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞的重要中介,樹突在黑素轉(zhuǎn)運(yùn)中起著至關(guān)重要的作用。紫外線是引起色沉增加的重要影響因素,紫外線照射在刺激黑素細(xì)胞黑素合成的同時(shí),通過增加樹突數(shù)量及長(zhǎng)度實(shí)現(xiàn)更高效的黑素轉(zhuǎn)運(yùn)[2-3]。有學(xué)者通過體外重建表皮模型證實(shí)中波紫外線(UVB)照射顯著促進(jìn)黑素小體轉(zhuǎn)

3、運(yùn),鏡下觀察黑素顆粒在表皮全層分布,黑素細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)發(fā)生明顯變化[4]。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中也證實(shí)UVB照射后可以誘導(dǎo)人黑素細(xì)胞PIG1樹突數(shù)量及長(zhǎng)度顯著增加,黑素小體向角質(zhì)形成細(xì)胞的傳遞增強(qiáng)[5],但具體機(jī)制尚未完全闡明。
　　microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)約22個(gè)nt的非編碼單鏈小RNA分子,可以通過與其調(diào)控的靶基因之間特異性的結(jié)合,降解靶mRNA或抑制翻譯等方式在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá),進(jìn)而參多種生物學(xué)功能,在細(xì)胞內(nèi)

4、具有重要的調(diào)節(jié)作用。miRNAs表達(dá)的時(shí)序性和組織特異性提示miRNAs的分布可能決定細(xì)胞和組織的功能特異性。既往有研究表明一些microRNAs參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞樹突棘發(fā)育[6-8],還有很多報(bào)道m(xù)iRNAs分子通過調(diào)控細(xì)胞骨架蛋白等信號(hào)通路,在細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生、遷移及運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[9-11]。此外,研究發(fā)現(xiàn)紫外線可以引起細(xì)胞內(nèi)microRNA表達(dá)譜變化,miRNAs分子可以在轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)控對(duì)UV誘導(dǎo)DNA損傷的應(yīng)答機(jī)制[

5、12]。以上提示我們?cè)诤谒丶?xì)胞內(nèi)可能存在特定的miRNAs分子參與調(diào)控樹突形態(tài)。因此,本課題擬在前期研究的基礎(chǔ)上,選擇100mJ/cm2UVB作為誘導(dǎo)條件,尋找與人表皮黑素細(xì)胞樹突形成相關(guān)的microRNA分子,研究miRNAs調(diào)控黑素細(xì)胞形態(tài)的分子機(jī)制及其在UVB誘導(dǎo)的樹突形成中的作用,完善黑素代謝基礎(chǔ)理論,探討miRNAs參與紫外線誘導(dǎo)皮膚色沉的分子機(jī)制,并為色素障礙性皮膚病的治療以及皮膚美容產(chǎn)品的研發(fā)提供新的思路和理論依據(jù)。

6、>　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　使用100mJ/cm2UVB照射人表皮黑素細(xì)胞PIG1,與UVB照射前的黑素細(xì)胞進(jìn)行microRNA表達(dá)譜差異分析,再通過Real-timePCR驗(yàn)證芯片結(jié)果,初步篩選相關(guān)的miRNA分子。轉(zhuǎn)染miRNA分子進(jìn)行形態(tài)學(xué)和功能學(xué)研究,觀察黑素細(xì)胞樹突數(shù)量及長(zhǎng)度的變化,觀察骨架蛋白F-actin和黑素小體在樹突的分布變化。生物信息預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miRNA可能調(diào)控的靶基因,雙熒光素酶報(bào)告載體驗(yàn)證預(yù)測(cè)的靶基因,RT-P

7、CR、WesternBlot證實(shí)miRNA分子對(duì)靶基因的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:
　　1.對(duì)microRNA芯片表達(dá)譜進(jìn)行分析后,我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,UVB照射后很多microRNA表達(dá)水平發(fā)生變化,UVB照射后3h與對(duì)照組相比有12個(gè)miR分子表達(dá)變化(Foldchange≥2.0),其中2個(gè)下調(diào),10個(gè)上調(diào)。UVB照射后24h,有3個(gè)顯著變化的miR分子(Foldchange≥2.0),其中1個(gè)上調(diào),3個(gè)下調(diào)。
　

8、　2.在黑素細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-340擬似物和抑制物后,分別成功上調(diào)和下調(diào)miR-340表達(dá)水平,與對(duì)照組相比,上調(diào)miR-340表達(dá)水平后,黑素細(xì)胞樹突數(shù)量、長(zhǎng)度均顯著增加(p<0.05);免疫熒光觀察到細(xì)胞內(nèi)F-actin形成的應(yīng)力纖維解聚,黑素小體在樹突末端的分布增加。
　　3.通過生物學(xué)軟件我們預(yù)測(cè)RhoA是miR-340的靶基因,報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí),miR-340可以與RhoA3’UTR的預(yù)測(cè)位點(diǎn)特異性結(jié)合,RT-PCR和W

9、esternblot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-340表達(dá)水平,RhoA的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化,而RhoA蛋白水平顯著下調(diào);下調(diào)miR-340表達(dá)水平,RhoA的mRNA無(wú)變化,蛋白水平上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.UVB照射可以誘導(dǎo)人黑素細(xì)胞PIG1的microRNA表達(dá)譜發(fā)生變化,靶基因預(yù)測(cè)和功能學(xué)分析提示microRNA可能參與多種生物學(xué)功能;UVB照射后microRNAs表達(dá)的時(shí)間差異性,提示UVB誘導(dǎo)的miRNAs表達(dá)

10、具有瞬時(shí)性,并且多集中于UVB照射早期。
　　2.miR-340在UVB照射前后的人黑素細(xì)胞表達(dá)具有差異性;miR-340能夠促使PIG1細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力纖維解聚,黑素細(xì)胞樹突長(zhǎng)度及數(shù)量增加,黑素小體向樹突末端的轉(zhuǎn)運(yùn)增加,說(shuō)明miR-340在黑素細(xì)胞樹突形成及黑素轉(zhuǎn)運(yùn)中的調(diào)控作用。
　　3.miR-340可能通過與靶基因RhoA3’UTR區(qū)的作用位點(diǎn)特異性結(jié)合抑制RhoA表達(dá),參與黑素細(xì)胞樹突形成。RhoA是調(diào)控骨架蛋白F-act