扇貝多肽經(jīng)Cathepsin B-Bid-Bax-Cytc信號通路抑制UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的：復(fù)制20 mJ/cm2的UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡模型，從溶酶體組織蛋白酶B(Cathepsin B，Cat B)/Bid/Bax/線粒體細(xì)胞色素c（Cytochrome c，Cyt c）的角度，研究扇貝多肽（Polypeptide from Chlamys farreri，PCF）抑制UVB輻射誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡的分子機制。
　　方法：建立20 mJ/cm2的UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡模型。實驗設(shè)計組別：對照組

2、、UVB模型組、UVB+1.42 mmol/L PCF組、UVB+2.84 mmol/L PCF組、UVB+5.69 mmol/L PCF組、UVB+5.68 mmol/L Vc陽性對照組、Control siRNA組、Bid-siRNA組、Bax-siRNA組和Cat B抑制劑CA-074Me（10mmol/L）組。以Hoechst33258熒光染色法檢測UVB輻射后18h細(xì)胞凋亡率，RT-PCR檢測Cat B、Bid、Bax mRN

3、A在UVB輻射后0、3、6、12、18、24h的經(jīng)時表達(dá)變化，RT-PCR和Western blot分別檢測PCF對Cat B、Bid、Bax mRNA和蛋白表達(dá)高峰點的保護(hù)作用；預(yù)先加入抑制劑CA-074Me及分別采用脂質(zhì)體Bid-siRNA、Bax-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞，Western blot檢測Cat B、Bid、Bax、Cyt c蛋白表達(dá)高峰點的變化。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。
　　結(jié)果：U

4、VB輻射后細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)，凋亡率達(dá)35.9％；與模型組相比，PCF可濃度依賴性地降低細(xì)胞凋亡率（P<0.05）。Cat B mRNA的經(jīng)時表達(dá)顯示UVB輻射HaCaT細(xì)胞后3h達(dá)到高峰（P<0.05）；Bid mRNA的經(jīng)時表達(dá)顯示UVB輻射HaCaT細(xì)胞后呈現(xiàn)兩次高峰，分別在3h和18h（P<0.05）；Bax mRNA的經(jīng)時表達(dá)顯示UVB輻射HaCaT細(xì)胞后6h達(dá)到高峰（P<0.05）。RT-PCR檢測結(jié)果表明，與模型組

5、相比，不同濃度的PCF和Vc能明顯下調(diào) Cat B、Bid和Bax mRNA的表達(dá)（P<0.05）。Bid蛋白檢測結(jié)果表明Bid可被剪切為t-Bid形式；PCF和Vc能明顯降低Cat B、t-Bid和Bax蛋白的表達(dá)（P<0.05）。加入抑制劑CA-074Me后較模型組相比能明顯減少Cat B、t-Bid、Bax的蛋白表達(dá)水平及線粒體Cyt c的釋放（P<0.05）；Bid表達(dá)被沉默后較模型組相比能明顯下調(diào)Bax蛋白表達(dá)水平和線粒體Cy