miR-126的表達譜分析及其功能的初步研究.pdf

1、心血管疾病作為人類的第一大疾病，其高發(fā)病率及死亡率一直受到世界各國的關注。其生理病理的機制和治療也一直是心血管領域的研究熱點。我們認為miR-126是一個人類心臟高表達的miRNA。因此，擬選定該miRNA，對其功能進行深入研究。本課題擬從以下幾個方面研究：首先我們擬在組織及細胞水平檢測miR-126的表達譜，明確miR-126在不同組織細胞的表達水平；其次，擬在293細胞中初步研究miR-126與VEGF3’-UTR的關系，通過外源表

2、達miR-126和攜帶VEGF3’-UTR的報告基因，通過檢測報告基因，明確miR-126對靶基因表達的調(diào)節(jié)。再次，構(gòu)建miR-126的慢病毒表達載體，并包裝重組慢病毒顆粒，檢測病毒梯度，建立miR-126過表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，利用分子生物學手段RPA、RT-PCR及Western blot明確上調(diào)miR-126表達對VEFG mRNA和蛋白表達的影響。另外，將表達miR-126的慢病毒感染內(nèi)皮細胞及不同的肺癌細胞株在細胞水平檢測miR-

3、126對VEGF表達的影響，最后我們用穩(wěn)轉(zhuǎn)表達1v-mir-126的A549細胞株接種到裸鼠體內(nèi)，在腫瘤動物模型體內(nèi)確定miR-126對VEGF表達的調(diào)控作用。 本研究的目的是檢測miR-126的表達譜，比較其組織及細胞水平的表達差異，并初步探討其高表達的作用。 第一部分：miR-126的表達譜分析 目的：分析miR-126在人體各組織及部分細胞的表達分布情況。 方法： 1、運用RNA酶保護法(R

4、NA Protective Assay，RPA)檢測：根據(jù)miR-126設計DNA片段(正義鏈)，并添加與mirVanaTM miRNA探針制備試劑盒中T7啟動子3’末端匹配的序列，合成DNA片段，然后與T7啟動子引物片段雜交，并使用Klenow DNA聚合酶補平，然后使用T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄32P標記的反義探針，加入DNase I消化DNA模板，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離探針，洗脫、沉淀并且重懸RNA探針，用于RNA酶保護檢測miR

5、-126。 2、運用RT-PCR方法檢測：根據(jù)miR-126的序列設計其特異的頸環(huán)狀逆轉(zhuǎn)錄引物及PCR擴增的前向及逆向引物，提取不同組織和細胞的RNA在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下先行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，cDNA在特異酶及引物的作用下行PCR，并在PCR反應體系中加入熒光探針，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對miR-126進行定量分析。 結(jié)果：RPA及RT-PCR結(jié)果均顯示miR-126主要在人的心臟、肺臟

6、及胃組織中高表達，在腎臟、大腦和骨骼肌中僅少量表達或無表達；在臍靜脈內(nèi)皮細胞中miR-126表達量明顯高于其他細胞，而在hela細胞、293細胞、A549細胞及Y90細胞等腫瘤細胞中miR-126的表達量極低。 結(jié)論：miR-126在人體各組織及細胞中表達有差異，其在心臟、肺及內(nèi)皮細胞中高表達而在腫瘤細胞中表達量明顯降低，提示miR-126可能參與這些組織細胞的病理生理過程。 第二部分： MiR-126靶基因的預測及初步

7、驗證 目的：通過生物信息學方法初步預測、并篩選出可能與心血管疾病密切相關的miRNA的靶基因，并通過熒光素酶報告基因系統(tǒng)確認miR-126對靶基因的作用。 方法：運用miRanda、TargetScan、PicTar、MiRanda和BibiServ等靶基因預測軟件檢索mir-126可能的靶基因，篩選出保守程度高、結(jié)合自由能低，并且與心血管病理生理過程相關的基因做為候選靶基因，我們選定VEGF為研究的靶基因，然后構(gòu)建螢火

8、蟲熒光素酶表達載體，在293細胞中驗證miR-126與VEGF之間的關系。將包含VEGF的3’-UTR區(qū)克隆入pMIR-REPORTTM Luciferase vector(pLuc，Ambion)載體編碼熒光素酶基因序列后，構(gòu)建pLuc-VEGF/miR-126BS重組質(zhì)粒。將pLuc-VEGF/miR-126BS重組質(zhì)粒和pLV-miR-126表達質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染分方法轉(zhuǎn)染293細胞，轉(zhuǎn)染后48小時，收集細胞，然后進行熒光素酶檢測

9、。系統(tǒng)采用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)，以海腎熒光素酶作為參照，檢測細胞干預前后熒光素酶的變化趨勢。同時采用點突變的方法使VEGF-3’UTR中miR-126的結(jié)合位點發(fā)生堿基突變，檢測其抑制作用是否消失。 結(jié)果：(1)通過不同的的預測軟件我們發(fā)現(xiàn)多種miR-126的可能靶基因，我們選定在心血管病理生理過程中發(fā)揮重要作用的VEGF作為我們研究的靶基因。(2)在293細胞中共轉(zhuǎn)染pIN-miR-126，可以抑制pLuc-VEGF/miR-1

10、26BS載體表達熒光素酶，而當3’-UTR進行突變修飾后，miR-126不能夠抑制其表達。 結(jié)論：生物學信息學預測VEGF可能是miR-126的靶基因，miR-126通過作用于VEGF的3’UTR端而起到抑制基因表達的作用。 第三部分：miR-126慢病毒生產(chǎn) 目的：構(gòu)建miR-126的慢病毒表達載體，包裝生產(chǎn)重組慢病毒，慢病毒滴度、活性測定。 方法：根據(jù)miR-126序列信息設計PCR引物，兩端分別添加

11、酶切位點和保護堿基。從A549細胞中提取人基因組DNA，以基因組DNA為模板，使用設計的引物進行PCR擴增，得到499bp的目的條帶，切膠回收PCR產(chǎn)物，然后雙酶切消化，瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。表達載體質(zhì)粒(pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPTM)也進行雙酶切消化，電泳后切膠回收。連接目的片段和表達載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株DH5a，涂布平板，過夜培養(yǎng)，使用PCR的方法進行陽性菌落鑒定。接種陽性菌落于LB培養(yǎng)基，搖床過夜

12、培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，然后使用載體多克隆位點上游的引物進行測序。分析測序結(jié)果，選擇測序正確的重組質(zhì)粒，搖床擴增其對應的轉(zhuǎn)化菌株，使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒進行無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA的提取。 結(jié)果：(1)成功調(diào)取miR-126基因序列，構(gòu)建miR-126的慢病毒表達載體。(2)成功進行了LV-miR-126重組病毒的生產(chǎn)和滴度測定。(3)慢病毒感染293細胞后，能夠大大增強目的基因的表達。 結(jié)論：通過慢病毒途徑可以有效增強miR-1

13、26在宿主細胞中的表達。 第四部分：在內(nèi)皮細胞中分析miR-126與VEGF表達之間的關系 目的：在內(nèi)皮細胞中分析miR-126與VEGF表達之間的調(diào)控關系 方法：(1)使用LV-miR-126慢病毒顆粒感染內(nèi)皮細胞，感染后72小時，收集細胞，然后分別提取總RNA和總蛋白，通過RPA和West Blot的方法觀察miR-126與VEGF之間的關系。(2)使用慢病毒LV-miR-126和對照LV-GFP感染內(nèi)皮細胞

14、，感染后72小時，取200μl細胞傳代到96孔板中，分別孵育24，48，72個小時，然后加入10μlMMT試劑，再孵育4小時，去除上清液，加入DMSO溶解，然后在酶標儀上檢測OD570，并使用OD630作為參照。 結(jié)果：(1)在內(nèi)皮細胞高表達miR-126，VEGF的表達水平明顯減低。(2)使用慢病毒感染內(nèi)皮細胞后，細胞可以高表達miR-126，但其增殖受到抑制。 結(jié)論：在內(nèi)皮細胞中過表達miR-126，可以抑制VEGF

15、表達，并且抑制內(nèi)皮細胞增殖。推測miR-126可能通過調(diào)節(jié)VEGF參與了內(nèi)皮相關疾病的病理生理過程。 第五部分：動物模型分析miR-126與VEGF表達之間的關系 目的：采用活體動物模型，分析miR-126與VEGF表達之間的關系 方法：(1)在肺癌細胞株A549、Y-90和SPC-A1中研究過表達miR-126對VEGF及細胞周期的影響(2)使用慢病毒LV-miR-126和對照LV-GFP感染上述三種肺癌細胞株

16、，感染后48小時，收集細胞，然后使用70％7，醇固定1小時，然后用PI染色，進行流式細胞儀檢測細胞周期。(3)使用Lv-miR-126和LV-GFP感染A549細胞，摸索適合細胞感染的最佳MOI值。根據(jù)最佳MOI值，進行A549細胞的病毒感染實驗。感染后每隔24小時進行觀察，待綠色熒光蛋白表達穩(wěn)定后，使用有限稀釋法進行單細胞克隆的篩選。得到細胞克隆之后，通過RT-PCR和West Blot的方法對細胞克隆進行性能檢測。(4)使用穩(wěn)定的A

17、549/LV-miR-126和A549/LV-GFP接種到裸鼠體內(nèi)，每只小鼠在左前足腋下接種2*106細胞。在25天后，處死小鼠，剪下腫瘤，然后稱重，確定miR-126過表達后對體內(nèi)腫瘤模型VEGF的抑制作用。 結(jié)果：(1)在肺癌細胞株A549、Y-90和SPC-Al高表達miR-126，可抑制VEGF的表達及抑制細胞增殖。(2)在肺癌細胞株A549、Y-90和SPC-Al使用慢病毒感染高表達miR-126，提高了處在G1期的細