CpG-ODN和多肽刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞殺傷HepG2研究.pdf

1、目的: 通過(guò)將CpG-ODN和多肽單獨(dú)或聯(lián)合刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），將活化后的PBMC 與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)，對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行殺傷，評(píng)價(jià)并比較CpG-ODN和多肽的刺激PBMC的殺傷HepG2 效應(yīng)，研究CpG-ODN的免疫激活功能和初步機(jī)制；進(jìn)一步研究CpG-ODN和多肽單獨(dú)或聯(lián)合刺激激活PBMC的作用機(jī)制，進(jìn)而探討CpG-ODN 免疫激活功能的作用機(jī)制和CpG-OND 刺激PBMC殺傷腫瘤的凋亡機(jī)制，初步探討

2、多肽刺激激活PBMC殺傷HepG2的效果和機(jī)制。 方法: 將還有CpG 寡核苷酸序列的pUC18 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于氨芐平板37℃培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性若干菌落于37℃小量液體培養(yǎng)，試劑盒抽提質(zhì)粒，酶切電泳鑒定； 將成功轉(zhuǎn)化的大腸桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)，去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，紫外分光光度法鑒定質(zhì)粒純度并計(jì)算含量。針對(duì)肝腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)針對(duì)甲胎蛋白的特異性抗原多肽，由公司合成特異性抗原多肽，多肽純度

3、達(dá)到適合細(xì)胞試驗(yàn)水平。使用植物凝集素作為刺激PBMC 增殖的陽(yáng)性對(duì)照，使用多肽、CpG-ODN、乙肝表面抗原、pUC18質(zhì)粒作為刺激物作用于PBMC，MTT 法檢測(cè)PBMC 增殖效果，使用Excel 統(tǒng)計(jì)作圖。設(shè)計(jì)合成針對(duì)TLR9 通道的MyD88、TLR9、Hsp70的PCR 引物，以β-actin 作為對(duì)照，不同濃度CpG-ODN 刺激PBMC，提取總RNA 并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行多聚酶鏈反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)MyD88、TLR9、H

4、sp70的表達(dá)情況。使用多肽、CpG-ODN和多肽聯(lián)合CpG-ODN刺激PBMC 后對(duì)HepG2 進(jìn)行殺傷，MTT 法檢測(cè)殺傷效果，使用Excel 統(tǒng)計(jì)作圖。提取PBMC 殺傷后的HepG2總RNA，反轉(zhuǎn)錄并使用Bcl-XL/S、ich3、Bid、Bcl-2為引物做聚合酶鏈反應(yīng)，以β-actin 作為對(duì)照，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)殺傷后HepG2的凋亡情況。 結(jié)果: CpG-ODN能有效刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖，刺激PBMC

5、增殖較為穩(wěn)定，作為佐劑，與多肽聯(lián)用具有更好的刺激增殖作用，但作為核酸與蛋白質(zhì)相比，蛋白抗原的刺激增殖能力更強(qiáng)；用不同劑量CpG-ODN刺激PBMC，在1μg/mL濃度時(shí)，TLR9通道的mRNA轉(zhuǎn)錄活性較強(qiáng)，0.1μg/mL和10μg/mL濃度mRNA轉(zhuǎn)錄活性低于1μg/mL濃度，抗凋亡因子Bcl-2的mRNA同樣在1μg/mL濃度有轉(zhuǎn)錄，但三個(gè)濃度Hsp70都無(wú)表達(dá)。在48h時(shí)間點(diǎn)，經(jīng)CpG-ODN介導(dǎo)活化的PBMC對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞

6、的有很強(qiáng)的殺傷活性，其中CpG單用組的殺傷能力最高。在48h的殺傷能力明顯高于在72h的殺傷能力。CpG單用組、CpG聯(lián)合多肽組、多肽單用組、PBMC無(wú)刺激物對(duì)照組和HepG2組在72h檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)上增殖活性均顯著高于48h檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)上的增殖活性。PCR結(jié)果中，多肽和CpG-ODN聯(lián)用凋亡因子Bcl-XL和Bid都有表達(dá)，單用多肽Bid也有表達(dá)。 結(jié)論： CpG-ODN和多肽能有效刺激發(fā)生PBMC 增殖反應(yīng)，CpG-ODN

7、 刺激PBMC細(xì)胞亞群較為廣泛，多肽刺激PBMC的細(xì)胞亞群具有一定的特異性。CpG-ODN 刺激PBMC 增殖效果穩(wěn)定，與蛋白質(zhì)或者多肽聯(lián)用刺激PBMC 有一定的協(xié)同刺激作用。在合適濃度情況下，CpG-ODN 刺激PBMC具有抗凋亡作用。CpG-ODN和多肽刺激PBMC 后，PBMC 殺傷HepG2能力增強(qiáng)，設(shè)計(jì)合成的多肽能與淋巴細(xì)胞腫瘤表位結(jié)合，特異性激活T細(xì)胞，CpG-ODN聯(lián)合多肽刺激PBMC 殺傷HepG2 能力具有一定的協(xié)同效