CpG-ODN的免疫增強(qiáng)功能和安全性研究.pdf

1、目的：通過(guò)將乙肝表面抗原和CpG-ODN單獨(dú)或聯(lián)合免疫BAL b/c小鼠，觀察小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平及其脾臟的組織形態(tài)學(xué)改變，評(píng)價(jià)CpG-ODN在小鼠全身和脾臟局部產(chǎn)生的免疫學(xué)效應(yīng)，探討CpG-ODN的免疫增強(qiáng)功能和可能的安全性問(wèn)題；并進(jìn)一步體外觀察經(jīng)乙肝表面抗原與CpG-ODN單獨(dú)或聯(lián)合體外刺激后小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性的動(dòng)態(tài)改變，評(píng)價(jià)CpG-ODN對(duì)乙肝表面抗原的免疫增強(qiáng)功能，進(jìn)而探討CpG-ODN是否可以作為乙肝表面抗原

2、的免疫佐劑。 方法：將CpG-ODN質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于氨芐平板37℃培養(yǎng)，挑取若干菌落于37℃小量液體培養(yǎng)，堿裂解法抽提質(zhì)粒，酶切電泳鑒定；將鑒定成功菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，紫外分光光度法鑒定質(zhì)粒的含量和純度。BAL b/c小鼠隨機(jī)分成五組：HBsAg和高劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組、HBsAg與CpG-ODN中劑量組、HBsAg和低劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組、HBsAg單用組和生理鹽

3、水對(duì)照組，分別于第0、2、4周免疫BAL b/c小鼠。于第1-8周斷尾采血，ELISA法檢測(cè)小鼠外周血中HBsAb和IFN-γ的水平；于第9周取脾，分離小鼠脾淋巴細(xì)胞，并分別用ConA和HBsAg體外刺激培養(yǎng)24h，XTT/PMS法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性；同時(shí)制備小鼠脾臟組織的石蠟切片，HE染色法觀察小鼠脾臟組織形態(tài)學(xué)改變。通過(guò)設(shè)立ConA組、HBsAg組、HBsAg與CpG-ODN聯(lián)用組、HBsAg與pUC18聯(lián)用組、CpG-OD

4、N組、pUC18組、細(xì)胞空白對(duì)照及培養(yǎng)基空白對(duì)照組， XTT/PMS法評(píng)價(jià)HBsAg和/或CpG ODN對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果：CpG-ODN質(zhì)粒的含量為3.75mg，OD260/OD280比值為1.77。HBsAg和高劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組、HBsAg和中劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組、HBsAg和低劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組的HBsAb水平均顯著高于HBsAg單用組 (p<0.05)；HBsAg和高劑量Cp

5、G-ODN聯(lián)合免疫組、HBsAg和中劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組的IFN-γ水平和脾淋巴細(xì)胞增殖活性均顯著高于HBsAg單用組和生理鹽水對(duì)照組(p<0.05)。HE染色提示，與HBsAg單用組和生理鹽水對(duì)照組相比，HBsAg和高劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組、HBsAg和中劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組、HBsAg和低劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組的小鼠脾臟的白髓、紅髓界限清晰，白髓中的動(dòng)脈周圍淋巴鞘增厚，脾小體數(shù)量增多，體積增大，脾小體可見

6、明顯的生發(fā)中心；紅髓充血明顯，脾索和脾血竇界限模糊。相對(duì)而言，HBsAg和CpG-ODN高、中劑量組的小鼠脾臟的動(dòng)脈周圍淋巴鞘較厚，脾小體體積較大，而HBsAg和低劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組小鼠脾臟紅髓充血較為明顯。HBsAg和高劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組的小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)尚清晰完整，未觀察到脾小體結(jié)構(gòu)形態(tài)的異常。XTT/PMS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CpG-ODN最適終濃度是5-10μg/mL；最適刺激培養(yǎng)時(shí)間為72h。 結(jié)論：CpG-