CpG-ODN減輕輻射損傷作用的效應(yīng)及其機(jī)理研究.pdf

1、隨著核能在軍事領(lǐng)域和民用領(lǐng)域中的普及應(yīng)用，其在巨大造福人類的同時，也給公眾的健康和安全帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。1954年發(fā)生在日本廣島和長崎的原子彈爆炸，1986年在前蘇聯(lián)切爾諾貝利核電站事故，以及最近在日本福島第一核電站的事故等，都給人類造成了重大災(zāi)難和巨大社會影響。我國是一個核大國，在軍事方面擁有大量核彈、核動力艦艇等戰(zhàn)略核武器，在民用方面也擁有多座核電站，從1991年秦山一期核電機(jī)組并網(wǎng)發(fā)電，到目前已有浙江秦山，廣東大亞灣/嶺澳和江蘇田

2、灣電站共11個核電機(jī)組投入商業(yè)運(yùn)行，總裝機(jī)容量達(dá)912萬千瓦，預(yù)計(jì)2020年我國核電總量將建成4000萬千瓦，2035年核電裝機(jī)容量將達(dá)到15000萬千瓦，這些意味著輻射工作人員和核設(shè)施周邊覆蓋的公眾將大幅度增加[1]，我們也面臨著核安全方面的考驗(yàn)。然而，關(guān)于對大劑量照射核事故傷員的救治方面的研究，目前最成功的方法是造血干細(xì)胞移植，但這種方法存在造血干細(xì)胞配型率低，來源困難和遠(yuǎn)期效果不理想等問題。所以開發(fā)一種容易生產(chǎn)，使用方便，治療效果

3、明顯的輻射損傷治療藥物或新途徑，作為一種戰(zhàn)略技術(shù)儲備迫在眉睫。
　　 近些年來，國外學(xué)者在研究Toll 樣受體及其激動劑時，取得了令人不可思議的發(fā)現(xiàn)。2008年Burdelya LG等在Science 雜志上報到了利用改良型Toll likereceptor 5 （TLR5）激動劑（一種沙門氏菌毛蛋白）激活TLR5信號分子，具有極強(qiáng)的減輕輻射損傷效應(yīng)，并且在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)即使在照射后2小時給予藥物仍然有較好的減輕輻射損傷效果，認(rèn)為T

4、LR5 激動劑介導(dǎo)的減輕輻射損傷作用的主要途徑是通過活化NF-κB （nuclear factor kappa B）實(shí)現(xiàn)[2]。這提示Toll 樣受體家族成員（Toll Like Receptors TLRs）及其激動劑在輻射損傷治療方面有著廣泛的研究前景。Burdelya LG等的發(fā)現(xiàn)無疑為研究輻射損傷治療劑開辟了一個新的領(lǐng)域。
　　 TLRs家族成員屬于進(jìn)化比較保守的模式識別受體（Pattern Recognition Re

5、ceptor,PRR）能夠識別病原微生物的相關(guān)分子模式（Pathogen Associated Molecular Patterns，PAMPs）。Toll蛋白是由Hashimoto等人于1988年首次在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)[3]，隨后JulesA Hoffmann 發(fā)現(xiàn)Toll蛋白介導(dǎo)果蠅的天然免疫，特別是可以抑制果蠅的真菌感染，它能感受入侵的病原體，使果蠅分泌多種抗微生物感染的多肽以清除病原體。1997年Medzhitov通過同源性分析首次

6、在人體內(nèi)分離出果蠅Toll蛋白的同系物，稱為人類Toll蛋白[4]。開啟了哺乳動物中TLRs與免疫系統(tǒng)研究的序幕。迄今，免疫學(xué)家已在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了11中TLR，并分別命名為TLR1～11[5]，他們均為I 型跨膜蛋白，其共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是膜外具有富亮氨酸重復(fù)序列，膜內(nèi)是一段結(jié)構(gòu)保守的區(qū)域，為細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的起始部位。TLRs 識別的PAMPs是一類高度保守的分子結(jié)構(gòu)，這些PAMPs分子結(jié)構(gòu)存在于病原體內(nèi)。TLRs與PAMPs 互相作用啟

7、動免疫反應(yīng)，激活機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)，不同TLRs 識別的PAMPs 也有差異，如TLR1、2、4和6 識別病原體的脂類部分；TLR5 識別病原體的蛋白質(zhì)分子：TLR3、7、8和9 識別病原體的核酸分子[6]。鑒于TLRs家族成員的結(jié)構(gòu)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和生物活性等大部分方面有共同相似之處，從理論上分析TLRs的其他家族成員可能也有輻射損傷治療效果，甚至效果更為顯著。
　　 TLR9是TLRs家族的重要成員之一，其PAMP 激動劑為C

8、pG-ODN[7]。
　　 CpG-ODN 被胞吞進(jìn)入細(xì)胞，與細(xì)胞質(zhì)中的TLR9 相互作用形成復(fù)合物，并通過髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88, MyD88）依賴的信號通路激活免疫應(yīng)答。MyD88和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（the TNF receptor associated factor,TRAF6）激活NF-κB 誘導(dǎo)激酶，繼而激活NF-κB 抑制物激酶，導(dǎo)致IκB （Inh

9、ibitorof NF-κB）磷酸化，NF-κB 被釋放出來，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活靶基因，啟動相關(guān)細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄[5]；CpG-ODN 也能通過其他信號通路，誘導(dǎo)和粒細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte Colony-Stimulating Factor, G-CSF）[8][9]，腫瘤壞死因子（Tumornecrosis factor-alpha, TNF-α）[10]，白介素6 （Interleukin-6, IL-6）[11]

10、，等細(xì)胞因子的高水平轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。如同其他TLR激動劑，CpG-ODN在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)治療[12][13]，抗病原體等過程中發(fā)揮著重要作用[14]，此外CpG-ODN在腫瘤的治療中也有重要的地位，與腫瘤抗原合用時，能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答及快速生成抗原特異性抗體，殺傷腫瘤細(xì)胞[15]。但是關(guān)于CpG-ODN在輻射損傷治療方面的研究依然是一片未知領(lǐng)域，值得開展深入探索。已有的文獻(xiàn)表明，TLR9 激動劑CpG-ODN 具有一系

11、列重要的生物活性，從理論上推測這些生物活性對抗輻射損傷應(yīng)該是十分有益的，其依據(jù)是：① TLR9與TLR5 有超高的同源性（圖示1），TLR9具有與TLR5 相似的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能夠活化NF-κB[5]；② TLR9 激動劑CpG-ODN能夠刺激免疫細(xì)胞分泌G-CSF， TNF-α，IL-6等，這些細(xì)胞因子都具有促進(jìn)造血系統(tǒng)損傷修復(fù)，減輕輻射損傷的作用。此外，TLR9 激動劑CpG-ODN與TLR5 激動劑細(xì)菌鞭毛蛋白比較，其毒性更低，獲取

12、更容易，文獻(xiàn)報道CpG-ODN 已被作為免疫調(diào)節(jié)劑用于臨床。將來我們?nèi)缒茏C實(shí)TLR9 激動劑CpG-ODN在減輕輻射損傷中也有極其重要作用，這無疑為輻射損傷治療藥物的研究帶來新的方向。
　　 本課題圍繞TLR9 激動劑CpG-ODN 輻射損傷治療作用進(jìn)行探索，主要研究內(nèi)容包括：CpG-ODN的設(shè)計(jì)和制備，并初步評價其對細(xì)胞和小鼠的毒性；CpG-ODN對骨髓造血系統(tǒng)輻射損傷的治療作用；CpG-ODN對小腸組織輻射損傷的治療作用；<

13、br>　　 CpG-ODN 輻射損傷治療作用機(jī)理。最終的結(jié)果表明CpG-ODN對輻射損傷具有較好的治療作用，擁有良好的應(yīng)用研究前景。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CpG-ODN2395 減輕輻射損傷的機(jī)制可能是激活NF-κB，提高機(jī)體抗氧化損傷能力和促進(jìn)G-CSF，TNF-α和IL-6與造血和免疫功能相關(guān)細(xì)胞因子的分泌。另外，文獻(xiàn)報道CpG-ODN 已被作為免疫調(diào)節(jié)劑用于臨床，本研究對CpG-ODN2395 初步毒性分析顯示無明顯的急性