慢性鼻-鼻竇炎組織重塑與炎癥的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　慢性鼻-鼻竇炎(Chronic rhinosinusitis, CRS)是鼻-鼻竇黏膜的持續(xù)性炎癥,是臨床上多種疾病的總稱,人群患病率約15％。按照國(guó)人的炎癥類型和組織學(xué)類型的不同分為伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎(CRSwNP)和不伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎(CRSsNP),其中根據(jù)嗜酸性粒細(xì)胞的百分比,又將伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎分為嗜酸性粒細(xì)胞性鼻息肉(Eos CRSwNP)和非嗜酸性粒細(xì)胞性鼻息肉(non-E

2、os CRSwNP)。對(duì)中國(guó)人的CRS的免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn),CRSsNP和CRSwNP的患者都表現(xiàn)為調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(Treg)的功能缺陷和TH1/TH2/TH17的反應(yīng)增強(qiáng)。CRSsNP主要以 TH1反應(yīng)為主,Eos CRSwNP主要以 TH2/TH17反應(yīng)為主,伴隨自然殺傷性 T細(xì)胞的浸潤(rùn),而non-Eos CRSwNP占中國(guó)人 CRSwNP的一半以上,卻沒(méi)有上述炎癥表現(xiàn)。
　　大量的研究表明,氣道的重塑包括上皮、間質(zhì)和黏膜下的改變

3、,最終導(dǎo)致氣道壁增厚。組織學(xué)上以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞增殖、血管形成、結(jié)締組織增多和組織破壞為特征。大量研究表明,這種重塑現(xiàn)象同樣存在于 CRS中,不同亞型的慢性鼻竇炎表現(xiàn)出不同的組織重塑特征。迄今為止,典型的鼻息肉組織重塑表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)中白蛋白積聚和水腫形成(即假性囊腫)。目前的研究表明這是因?yàn)楸窍⑷庵邢鄬?duì)缺乏 TGF-β1信號(hào),細(xì)胞外基質(zhì)缺乏膠原的形成。與此相反,CRSsNP以TH1反應(yīng)為主,伴隨高水平的IFN-gam

4、ma和活化的TGF-β1信號(hào),以及因此導(dǎo)致的過(guò)量的膠原沉積和纖維化形成。然而,對(duì)于不同類型的CRS,特別是 Eos CRSwNP和non-Eos CRSwNP之間的差別,這種重塑的特征很少見(jiàn)諸報(bào)道。此外,組織的重塑是否和炎癥類型有關(guān)也是一個(gè)具有爭(zhēng)議的話題。
　　本研究就旨在揭示不同類型的CRS的組織學(xué)特征及其與炎癥類型之間的關(guān)系。
　　研究目標(biāo)：
　　1.分析不同類型的CRS組織學(xué)特征,及其在各組中的比例。
　　

5、2.分析不同類型 CRS的炎癥類型。
　　3.研究不同的組織學(xué)特征和炎癥類型之間的關(guān)系,是否有相關(guān)性。
　　研究方法：
　　1.組織學(xué)分析
　?、倜庖呓M織化學(xué)方法 HE染色檢測(cè)不同類型 CRS的組織學(xué)特征,按照 Hellquist的分類,將 CRS分為纖維化型、水腫型、腺體型和不典型型。由于不典型型非常罕見(jiàn),且組織學(xué)體現(xiàn)為肉瘤或惡變的細(xì)胞學(xué)特征,事實(shí)上隨訪研究并不支持腫瘤的診斷。因此,我們暫不考慮這一型。

6、　?、诜治雒糠N組織學(xué)類型在各種 CRS中的比例。
　　③ Masson染色,分析各種 CRS亞型的水腫評(píng)分和膠原比例。
　　④免疫組織化學(xué)檢測(cè) TGF-β2、MPO、HIF-1α、α-SMA、fibronectin、TIMP-4等蛋白的定位、分布和表達(dá)量。計(jì)數(shù) HE染色切片每高倍鏡視野下嗜酸性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)。
　?、葸B續(xù)切片免疫組化染色觀察分析 MPO陽(yáng)性細(xì)胞與 TGF-β2或HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞之間的關(guān)系。
　　2

7、.實(shí)時(shí)定量 RT-PCR
　　檢測(cè)可能與組織重塑有關(guān)的細(xì)胞因子,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α、肝素結(jié)合上皮生長(zhǎng)因子 heparin-binding epithelial growth factor(HB-EGF),白介素 interleukin(IL)-8,嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白 eosinophil cationic protein(ECP),金屬基質(zhì)蛋白酶 metallopr

8、oteinase(MMP)-2,MMP-7,金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑 TIMP-1 and TIMP-4等的mRNA含量。
　　3.相關(guān)性分析
　　分析上述有意義的指標(biāo)間的相關(guān)性,判斷組織重塑與炎癥類型之間的相關(guān)性。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.不同類型的CRS的重塑類型
　?、俑鶕?jù) Hellquist的分類,CRS基于組織學(xué)特征可分為水腫型、腺體增生型、纖維型和非典型型。而非典型型的特征為間質(zhì)中大而多形性的組織細(xì)

9、胞,這一類型非常罕見(jiàn),因此本文著重研究其他三種類型。
　　② Eos CRSwNP中水腫型最常見(jiàn)[70.8％(51/72)],比例顯著高于 non-Eos CRSwNP[43.4％(33/76)](P=0.001)和CRSsNP[20.8％(15/72)](P=0.000)。 non-Eos CRSwNP水腫型的比例顯著高于 CRSsNP(P=0.005)。
　?、叟c此相反,Eos CRSwNP中纖維型比例最少見(jiàn)[12.5％

10、(9/72)],顯著少于 non-Eos CRSwNP[37.1％(26/70)](P=0.001)和CRSsNP[49.3％(38/77)](P=0.000)。
　?、鼙M管腺體增生型的比例從 Eos CRSwNP[16.7％(12/72)]到 non-Eos CRSwNP[20.0％(14/70)]到 CRSsNP[29.9％(23/77)]呈遞增趨勢(shì),但是沒(méi)有顯著性差異。
　　⑤ Masson染色發(fā)現(xiàn)在 Eos CRSw

11、NP和non-Eos CRSwNP中膠原的含量顯著低于Controls,而CRSsNP的膠原含量顯著高于 Controls。盡管在 Eos CRSwNP和non-Eos CRSwNP的膠原含量均少于 CRSsNP,但是 non-Eos CRSwNP的膠原含量顯著高于 Eos CRSwNP。
　?、夼c此相反,Eos CRSwNP和non-Eos CRSwNP的水腫評(píng)分顯著高于 CRSsNP和Controls;而Eos CRSwNP的

12、水腫評(píng)分顯著高于 non-Eos CRSwNP。
　　2.α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和纖維蛋白原(fibronectin)的表達(dá)
　　①α-SMA陽(yáng)性染色主要分布于間質(zhì),在上皮無(wú)表達(dá)。間質(zhì)中α-SMA陽(yáng)性的應(yīng)力纖維除了血管壁的成分外均被認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts)肌成纖維細(xì)胞的數(shù)目從 Eos CRSwNP、non-Eos CRSwNP和CRSsNP呈現(xiàn)遞增趨勢(shì),但只有 Eos CRSwNP和CRS

13、sNP之間存在顯著性差異。
　?、诶w維蛋白原的表達(dá)情況與α-平滑肌肌動(dòng)蛋白一致。
　　3.生長(zhǎng)因子、蛋白酶和蛋白酶抑制劑的表達(dá)
　　①我們檢測(cè)了TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3的m RNA水平,發(fā)現(xiàn)在各種類型的CRS中,TGF-β1水平均較對(duì)照組(Controls)下降;而CRSsNP中TGF-β2的mRNA水平顯著高于 Eos CRSwNP和Controls;TGF-β3的mRNA水平在幾組中無(wú)顯著性差異。<

14、br>　?、?CRSsNP中HB-EGF的mRNA水平顯著高于 non-Eos CRSwNP、Eos CRSwNP和Controls。
　?、鄞送?我們檢測(cè)了MMP-2、 MMP-7、TIMP-1和TIMP-4的mRNA水平。Eos CRSwNP和non-Eos CRSwNP中MMP-2的水平顯著低于 Controls,而MMP-7的水平在 CRS各組中均較 Controls組上調(diào)。而TIMP-4在 Eos CRSwNP中的mRN

15、A水平顯著低于 Controls和CRSsNP;TIMP-1的mRNA水平在各種中無(wú)顯著差異。
　?、芑谏鲜龅膍RNA水平的檢測(cè),我們進(jìn)一步檢測(cè)了鼻黏膜中TGF-β2和TIMP-4蛋白水平的表達(dá),發(fā)現(xiàn) TGF-β2和TIMP-4均表達(dá)與黏膜的上皮和間質(zhì)。TGF-β2陽(yáng)性的細(xì)胞廣泛分布于各種 CRS的間質(zhì)。而TIMP-4陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于腺體細(xì)胞和血管和腺體周圍的細(xì)胞。所有類型的CRS間質(zhì)中TGF-β2陽(yáng)性的細(xì)胞顯著多于 Cont

16、rols,而在 CRSsNP中的表達(dá)顯著多于 Eos CRSwNP和non-Eos CRSwNP。但是上皮中TGF-β2的表達(dá)在各種中無(wú)顯著差異。CRSsNP間質(zhì)中TIMP-4陽(yáng)性細(xì)胞顯著多于 Eos CRSwNP、non-Eos CRSwNP和Controls;而TIMP-4在 Eos CRSwNP的表達(dá)顯著低于其他組。TIMP-4在各組上皮的表達(dá)無(wú)顯著性差異。
　　4.炎癥和組織重塑之間的關(guān)系
　?、傥覀?cè)u(píng)估了不同類型

17、CRS的炎癥類型。相比于 Controls, non-Eos CRSwNP和CRSsNP,Eos CRSwNP中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量和ECP的mRNA水平顯著上調(diào)。與此相反,中性粒細(xì)胞(MPO陽(yáng)性細(xì)胞)的數(shù)量在所有類型的CRS中顯著高于 Controls;且中性粒細(xì)胞的數(shù)量從 Eos CRSwNP到 non-Eos CRSwNP再到 CRSsNP呈現(xiàn)顯著的遞增趨勢(shì)。IL-8的m RNA水平在 CRSsNP中較其他組顯著上調(diào)。此外,我們檢測(cè)

18、了能反應(yīng)病變鼻竇低氧狀態(tài)的HIF-1α的表達(dá)水平。從 Controls-Eos CRSwNP-non-Eos CRSwNP-CRSsNP,HIF-1α的mRNA水平和蛋白表達(dá)呈現(xiàn)遞增趨勢(shì),但只有在 Controls和non-Eos CRSwNP之間、Eos CRSwNP和CRSsNP之間呈現(xiàn)顯著性差異。HIF-1α主要表達(dá)于間質(zhì)中炎性細(xì)胞的胞核,少數(shù)表達(dá)于上皮細(xì)胞的胞核。
　　②分析炎癥指標(biāo)和重塑介質(zhì)之間的相關(guān)性,我們發(fā)現(xiàn),中性粒

19、細(xì)胞數(shù)與這些前纖維化因子呈正相關(guān),而ECP的mRNA水平與其呈負(fù)相關(guān)。相反,ECP的mRNA水平與水腫嚴(yán)重程度呈正相關(guān)而中性粒細(xì)胞數(shù)與其呈反相關(guān)。此外,還發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞的數(shù)量與 IL-8和HIF-1α的表達(dá)水平呈正相關(guān),而ECP的mRNA水平與其呈反相關(guān)。TGF-β2陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)與肌成纖維細(xì)胞數(shù)(r=0.715, P<0.05)和纖維蛋白原的表達(dá)水平(r=0.696, P<0.05)呈正相關(guān)。此外,HB-EGF與TGF-β2的表達(dá)之間呈

20、正相關(guān)(r=0.702, P=0.03)。HIF-1α mRNA水平與 IL-8(r=0.517, P<0.05)和TGF-β2(r=0.629, P<0.05) mRNA水平呈正相關(guān)。
　?、蹫榱烁M(jìn)一步驗(yàn)證中性粒細(xì)胞和TGF-β2及HIF-1α之間的關(guān)系,我們利用免疫組化連續(xù)切片觀察中性粒細(xì)胞和TGF-β2之間,以及中性粒細(xì)胞和HIF-1α之間的染色定位及相關(guān)性。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)在 controls組中,TGF-β2陽(yáng)性的中

21、性粒細(xì)胞占 TGF-β2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的26％;在 Eos CRSwNP中占40％;在non-Eos CRSwNP中占60％;在 CRSsNP中占77％。TGF-β2陽(yáng)性的中性粒細(xì)胞比例在各種 CRS中顯著高于 controls組(P<0.05),而在 non-Eos CRSwNP和CRSsNP中顯著高于 Eos CRSwNP。TGF-β2陽(yáng)性的中性粒細(xì)胞占所有中性粒細(xì)胞的比例在 controls組為79％,Eos CRSwNP組為75％,

22、non-Eos CRSwNP組為80％,CRSsNP組為85％,這幾組中的比例無(wú)顯著性差異。對(duì)于 HIF-1α,我們發(fā)現(xiàn)在 controls組中HIF-1α陽(yáng)性的中性粒細(xì)胞數(shù)占 HIF-1α總陽(yáng)性細(xì)胞的20％,在 Eos CRSwNP中占26％,non-Eos CRSwNP中37％,在 CRSsNP中占43％;這一比例在 non-Eos CRSwNP和CRSsNP中顯著高于 controls組和Eos CRSwNP組(P<0.05)。另

23、外,在 controls組中HIF-1α陽(yáng)性的中性粒細(xì)胞數(shù)占總的中性粒細(xì)胞數(shù)的78％,在 Eos CRSwNP中占81％,在 non-Eos CRSwNP中占85％,在 CRSsNP中占87％;這幾組中的陽(yáng)性比例無(wú)顯著性差異。non-Eos CRSwNP和CRSsNP中的TGF-β2和HIF-1α陽(yáng)性的中性粒細(xì)胞數(shù)顯著高于controls組和Eos CRSwNP(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　不同類型的CRS具有不同的組