調(diào)控玉米大斑病菌生長發(fā)育和致病性的STK基因的克隆與功能分析.pdf

1、由凸臍蠕孢菌引起的玉米大斑病是玉米生產(chǎn)上的重要病害之一，常造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。研究表明，MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是真菌中普遍存在的細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并對(duì)植物病原真菌的生長、發(fā)育和致病性有重要的調(diào)控作用。本文利用候選基因法克隆了玉米大斑病菌中的3個(gè)MAPK基因(STK1、STK2、STK3)，分別與調(diào)控玉米大斑病菌的滲透脅迫調(diào)節(jié)、致病性與分生孢子發(fā)育、細(xì)胞壁合成等3種類型的已知MAPK基因有非常高的同源性。在獲得玉米大斑病菌STK1基因突變體

2、的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了玉米大斑病菌STK1基因的表達(dá)研究，確定了STK1基因在玉米大斑病菌分生孢子發(fā)育和滲透脅迫調(diào)節(jié)方面的重要功能，為研究其他MAPK基因提供了思路和方法。經(jīng)對(duì)玉米大斑病菌STK1基因反義誘導(dǎo)表達(dá)突變體的構(gòu)建，不僅為該基因作為靶基因進(jìn)行病害防治奠定基礎(chǔ)，而且STK1基因正義誘導(dǎo)表達(dá)突變體的構(gòu)建還將為該基因在其它物種中的轉(zhuǎn)化以及研究該基因與其它基因之問的關(guān)系提供了材料。對(duì)ATMT突變體和黑色素缺失突變體中STK1基因表達(dá)的研究，

3、證明了玉米大斑病菌調(diào)控生長和發(fā)育有著更復(fù)雜的機(jī)制。本文主要結(jié)果如下： 1．利用候選基因法克隆了3個(gè)玉米大斑病菌MAPK基因，即STK1，STK2和STK3。其中STK1和STK2基因獲得了基因的cDNA全長和DNA全長，STK3基因?yàn)橐粋€(gè)片段，獲得了該基因的部分DNA序列。STK1基因cDNA全長和DNA全長的獲得使前期研究獲得的STK1基因片段得到完整化，并對(duì)GenBank中登錄的該基因進(jìn)行了更新(登錄號(hào)為AY849317)。

4、 2.對(duì)STK1、STK2和STK3基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。STK1基因DNA全長1506bp，cDNA全長1071bp，編碼356個(gè)氨基酸，有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，外顯子1071bp，內(nèi)含子共435bp;STK2基因DNA全長1277bp，cDNA全長1059bp，編碼352個(gè)氨基酸，含有5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子，外顯子共1059bp，內(nèi)含子共218bp；STK3基因片段長度為591bp，可能存在3個(gè)內(nèi)含子，共172bp，4個(gè)外

5、顯子總長419bp，該基因的編碼序列從該片段的第3位開始，編碼區(qū)域?yàn)?17 bp，預(yù)測編碼蛋白中含有139個(gè)氨基酸。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的所有內(nèi)含子均符合GT-AG法則。 3．對(duì)玉米大斑病菌STK1、STK2和STK3三個(gè)MAPK基因的同源性和功能進(jìn)行了分析和比較，其中STK1基因可能主要與滲透脅迫和應(yīng)激脅迫調(diào)節(jié)有關(guān)；STK2基因主要與病菌的致病性和孢子發(fā)育有關(guān)；STK3基因主要與細(xì)胞壁合成有關(guān)。為了明確STK1基因的表達(dá)量的變化，本試驗(yàn)

6、獲得了長度為1287bp的玉米大斑病菌β-微管蛋白基因片段，該序列與玉米小斑病菌的β-微管蛋白基因同源性均為100％。以該基因?yàn)閮?nèi)參，利用半定量RT-PCR技術(shù)，研究了高滲條件對(duì)玉米大斑病菌STK1基因表達(dá)的影響，在高滲處理8h內(nèi)，STK1基因的表達(dá)量比較穩(wěn)定，但超過8h后，STK1基因的表達(dá)量迅速下降。 4．在高滲脅迫條件下，玉米大斑病菌的菌落形態(tài)、顏色、生長速度發(fā)生嚴(yán)重變化，但STK1基因突變體則變化不明顯。 5．利

7、用原核表達(dá)載體pET28a(+)及原核表達(dá)宿主菌BL21構(gòu)建了玉米大斑病菌STK1基因的原核表達(dá)載體STK1-pET28a(+)，并成功進(jìn)行了STK1基因的原核表達(dá)分析。為STK1蛋白的分離和在細(xì)胞中的定位研究奠定了基礎(chǔ)。Southem雜交結(jié)果表明，玉米大斑病菌的STK1基因在基因組中以單拷貝形式存在。 6．在優(yōu)化玉米大斑病菌原生質(zhì)體制備和再生條件的基礎(chǔ)上，根據(jù)基因同源重組原理構(gòu)建了含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和氨芐青霉素基因兩個(gè)抗

8、性標(biāo)記的STK1基因敲除載體，通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，獲得了246個(gè)抗性轉(zhuǎn)化子，通過使用設(shè)計(jì)的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移霉基因特異性引物及STK1基因特異性引物對(duì)轉(zhuǎn)化子的篩選，得到了一個(gè)STK1基因突變體，命名為STM-35。STK1基因敲除突變體STM-35的菌絲灰白色、氣生菌絲少，菌落低矮，菌落中部菌絲呈浸潤狀，菌絲細(xì)胞中色素沉積少、菌絲較透明，沒有發(fā)現(xiàn)分生孢子的形成，提取的HT-毒素對(duì)感病寄主葉片的毒力顯著下降，致病性分析表明，該突變體

9、的致病性大大降低。 7．基于pSOI質(zhì)粒構(gòu)建了玉米大斑病菌STK1基因的反義和正義誘導(dǎo)表達(dá)載體，獲得了30個(gè)反義轉(zhuǎn)化子，其中有5個(gè)轉(zhuǎn)化子為反義抑制突變體，它們與STK1基因敲除突變體的表現(xiàn)基本一致。在構(gòu)建玉米大斑病菌ATMT突變體庫的基礎(chǔ)上，對(duì)與STK1基因突變體在菌落和菌絲形態(tài)方面非常相似、也不產(chǎn)生分塵孢子的ATMT突變體STAM-26，進(jìn)行了STK1基因的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)該突變體中STK1基因能夠正常表達(dá)，說明調(diào)控玉米大斑病菌