玉米大斑病菌STK2基因與StMSG5基因的功能研究.pdf

1、本研究從玉米大斑病菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中克隆得到了1個(gè)MAPK激酶基因STK2，利用酵母異源互補(bǔ)技術(shù)初步明確了其功能，發(fā)現(xiàn)該基因能互補(bǔ)釀酒酵母FUS3/KSS1在絲狀生長(zhǎng)、侵入生長(zhǎng)及子囊孢子形成等方面的功能;克隆得到了1個(gè)磷酸酶基因StMSG5，利用基因敲除技術(shù)對(duì)該基因功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)Σ【L(zhǎng)發(fā)育及侵入過(guò)程具有負(fù)調(diào)控作用。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、克隆的玉米大斑病菌STK2基因cDNA全長(zhǎng)為1092 bp、編碼363個(gè)氨

2、基酸。生物信息學(xué)分析表明，該基因與絲狀真菌的FUS3/KSS1-like基因有較高的同源性。
　　 2、構(gòu)建了釀酒酵母表達(dá)載體pVT102U-STK2，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母fus3/kss1基因缺失突變體，通過(guò)氨基酸合成缺陷培養(yǎng)基的篩選、PCR及RT-PCR的驗(yàn)證獲得了STK2基因互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子（互補(bǔ)釀酒酵母fus3/kss1基因缺失突變體）。
　　 3、通過(guò)對(duì)STK2基因互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子與野生型菌株的生長(zhǎng)發(fā)育特征比較，發(fā)現(xiàn)二

3、者在假菌絲形成、侵入生長(zhǎng)、子囊孢子發(fā)育等方面具有類(lèi)似的特征，表明玉米大斑病菌STK2基因與釀酒酵母FUS3、KSS1基因具有類(lèi)似的功能。
　　 4、搜索JGI網(wǎng)站(http://genome.jgi-psf.org)上公布的玉米大斑病菌基因組序列，得到了作用于STK2基因的磷酸酶基因StMSG5序列。該基因DNA全長(zhǎng)為1521 bp，cDNA全長(zhǎng)1464 bp，含有1個(gè)內(nèi)含子，其長(zhǎng)度為57bp。生物信息學(xué)分析表明，該基因?qū)儆贛S

4、G5-like基因，可能具有使FUS3/KSS1-like激酶去磷酸化的作用。
　　 5、以pBS-pUC質(zhì)粒為基本骨架，構(gòu)建了StMSG5的敲除載體，經(jīng)PEG3350介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，用50μg/mL的潮霉素B篩選、特異引物PCR和RT-PCR驗(yàn)證，得到了1株StMSG5基因敲除突變體△StMSG5。
　　 6、通過(guò)對(duì)StMSG5基因敲除突變體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)分生孢子的產(chǎn)量較野生型菌株明顯增多，附著胞的穿透能力增強(qiáng)，但