玉米大斑病菌MAPK級聯(lián)途徑中STK2基因的功能研究.pdf

1、由玉蜀黍大斑剛毛座腔菌（Setosphaeria turcica）引起的玉米大斑病是玉米生產(chǎn)上的重要病害之一，常造成嚴重經(jīng)濟損失。研究表明，MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑是真菌中普遍存在的細胞外信號轉(zhuǎn)導途徑，并對植物病原真菌的生長、發(fā)育和致病性有重要的調(diào)控作用。本論文通過基因敲除技術(shù)創(chuàng)制STK2基因的缺失突變體來研究玉米大斑病菌MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑中STK2基因的功能。初步明確了玉米大斑病菌信號轉(zhuǎn)導途徑中的STK2基因在玉米大斑病菌分生孢子發(fā)育、

2、附著胞形成、致病性及次生物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)等方面的重要功能，為研究其他信號轉(zhuǎn)導調(diào)控基因提供了思路和方法。
　　 根據(jù)實驗室前期已克隆得到的STK2基因的DNA序列分別設計5'和3'特異性引物，以玉米大斑病菌基因組DNA為模板，利用Genome walking技術(shù)得到了STK2的DNA側(cè)翼序列，最終得到了STK2基因5'端1 951 bp、3'端1 062 bp的非編碼區(qū)，使用國際上通用的啟動子分析軟件Sofeberry、NNPP對其進

3、行啟動子活性區(qū)域分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在起始密碼子前1056 bp左右范圍內(nèi)有強的啟動子和增強子活性結(jié)構(gòu)，其中在起始密碼子前356 bp和1 562 bp處存在CAAT BOX，沒有發(fā)現(xiàn)TATA BOX，存在3個GpC島。另外利用生物信息學軟件對STK2基因編碼的蛋白進行結(jié)構(gòu)及功能預測。
　　 根據(jù)基因同源重組原理，以潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因取代STK2基因的部分編碼區(qū)序列，構(gòu)建了含有潮霉素B抗性標記的STK2基因敲除載體。利用重組DNA

4、片段通過PEG介導轉(zhuǎn)化玉米大斑病菌原生質(zhì)體，獲得了潮霉素B抗性轉(zhuǎn)化子，通過潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因特異性引物和STK2基因特異性引物對轉(zhuǎn)化子進行PCR篩選，并以潮霉素基因為探針進行Southern blot驗證，最終確定1個轉(zhuǎn)化子為突變體，命名為Δstk2。對突變體菌株Δstk2進行了表型分析，結(jié)果顯示，Δstk2菌株菌絲呈白色、氣生菌絲稠密，菌落低矮，菌落中部菌絲呈灰白色氈狀，其生長速率明顯大于野生型。生物測定結(jié)果表明，該菌株的HT-毒素

5、對感病寄主葉片的毒力顯著下降；突變菌株在洋蔥表皮上不能夠萌發(fā)產(chǎn)生附著胞進而不能侵入洋蔥表皮；取其菌盤接種于感病寄主葉片，不能導致寄主發(fā)??；此外，突變體菌株對高滲脅迫的耐受能力不及野生型菌株。
　　 PCR擴增STK2基因的ORF，將其克隆到穿梭質(zhì)粒pPIC9K中，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)PCR和測序鑒定后，提取測序正確的pPIC9K-STK2重組載體質(zhì)粒，線性化后電擊轉(zhuǎn)化GS115畢赤酵母菌株，使用G418篩選出穩(wěn)定表達的酵母重組子，經(jīng)