玉米大斑病菌MAPK級(jí)聯(lián)途徑中STK2基因的功能研究.pdf

1、由玉蜀黍大斑剛毛座腔菌（Setosphaeria turcica）引起的玉米大斑病是玉米生產(chǎn)上的重要病害之一，常造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。研究表明，MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是真菌中普遍存在的細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并對(duì)植物病原真菌的生長(zhǎng)、發(fā)育和致病性有重要的調(diào)控作用。本論文通過基因敲除技術(shù)創(chuàng)制STK2基因的缺失突變體來(lái)研究玉米大斑病菌MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中STK2基因的功能。初步明確了玉米大斑病菌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的STK2基因在玉米大斑病菌分生孢子發(fā)育、

2、附著胞形成、致病性及次生物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)等方面的重要功能，為研究其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控基因提供了思路和方法。
　　 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期已克隆得到的STK2基因的DNA序列分別設(shè)計(jì)5'和3'特異性引物，以玉米大斑病菌基因組DNA為模板，利用Genome walking技術(shù)得到了STK2的DNA側(cè)翼序列，最終得到了STK2基因5'端1 951 bp、3'端1 062 bp的非編碼區(qū)，使用國(guó)際上通用的啟動(dòng)子分析軟件Sofeberry、NNPP對(duì)其進(jìn)

3、行啟動(dòng)子活性區(qū)域分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在起始密碼子前1056 bp左右范圍內(nèi)有強(qiáng)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子活性結(jié)構(gòu)，其中在起始密碼子前356 bp和1 562 bp處存在CAAT BOX，沒有發(fā)現(xiàn)TATA BOX，存在3個(gè)GpC島。另外利用生物信息學(xué)軟件對(duì)STK2基因編碼的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)。
　　 根據(jù)基因同源重組原理，以潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因取代STK2基因的部分編碼區(qū)序列，構(gòu)建了含有潮霉素B抗性標(biāo)記的STK2基因敲除載體。利用重組DNA

4、片段通過PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米大斑病菌原生質(zhì)體，獲得了潮霉素B抗性轉(zhuǎn)化子，通過潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因特異性引物和STK2基因特異性引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR篩選，并以潮霉素基因?yàn)樘结樳M(jìn)行Southern blot驗(yàn)證，最終確定1個(gè)轉(zhuǎn)化子為突變體，命名為Δstk2。對(duì)突變體菌株Δstk2進(jìn)行了表型分析，結(jié)果顯示，Δstk2菌株菌絲呈白色、氣生菌絲稠密，菌落低矮，菌落中部菌絲呈灰白色氈狀，其生長(zhǎng)速率明顯大于野生型。生物測(cè)定結(jié)果表明，該菌株的HT-毒素

5、對(duì)感病寄主葉片的毒力顯著下降；突變菌株在洋蔥表皮上不能夠萌發(fā)產(chǎn)生附著胞進(jìn)而不能侵入洋蔥表皮；取其菌盤接種于感病寄主葉片，不能導(dǎo)致寄主發(fā)?。淮送?，突變體菌株對(duì)高滲脅迫的耐受能力不及野生型菌株。
　　 PCR擴(kuò)增STK2基因的ORF，將其克隆到穿梭質(zhì)粒pPIC9K中，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定后，提取測(cè)序正確的pPIC9K-STK2重組載體質(zhì)粒，線性化后電擊轉(zhuǎn)化GS115畢赤酵母菌株，使用G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)的酵母重組子，經(jīng)