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文檔簡介
1、目的:本研究旨在探討CD8+T細(xì)胞是否啟動了胰島炎,如果是,CD8+T細(xì)胞是怎樣啟動糖尿病發(fā)生的。 方法:用NOD鼠和基因工程構(gòu)建的NOD背景的轉(zhuǎn)基因鼠作為本研究的動物模型,用PCR和流式細(xì)胞技術(shù)鑒定實(shí)驗(yàn)動物的基因型。 結(jié)果: 1.14天齡NOD鼠的脾細(xì)胞被轉(zhuǎn)移給6~8周齡的NOD.scid鼠和年齡匹配的NOD.scid.Rip.B7鼠,在轉(zhuǎn)移脾細(xì)胞后9周,當(dāng)68.6%NOD.scid.Rip.B7受鼠發(fā)生糖尿病時(shí)
2、,NOD.sicd受鼠組尚沒有檢測到胰島淋巴細(xì)胞浸潤。轉(zhuǎn)移脾細(xì)胞后11周,80%的NOD.scid.Rip.B7鼠發(fā)生糖尿病(圖13 B所示)。但在NOD.sod受鼠組,即使轉(zhuǎn)移后20周,尚沒有1例受鼠發(fā)生糖尿病。 2.我們將相同數(shù)量的、不同周齡的NOD鼠的脾細(xì)胞分別轉(zhuǎn)移給相同周齡的NOD.sicd受鼠,觀察T細(xì)胞的致糖尿病能力在不同周齡NOD供鼠的變化。 3.從已發(fā)生糖尿病的NOD鼠分離脾細(xì)胞并注射給新生的(n=30)
3、以及1周齡,2周齡(n=34),3周齡(n=32),6周齡(n=36)的NOD.sicd鼠。所有年齡組的受鼠均在接受轉(zhuǎn)移細(xì)胞后5周左右開始發(fā)病,轉(zhuǎn)移后9周時(shí)所有年齡組受鼠100%發(fā)病。盡管受鼠的年齡不同,但它們發(fā)生糖尿病的時(shí)間卻相似(圖13A)。經(jīng)行×列表資料的x2檢驗(yàn),P>0.05,說明在轉(zhuǎn)移后同一時(shí)間,不同周齡的受鼠糖尿病發(fā)病率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.從9~10天齡的BDC2.5/NOD.scid鼠的脾臟分離出BDC2.5
4、 CD4+T細(xì)胞,將5×105個(gè)CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)移給6~8周齡的NOD.scid鼠(n=40)和NOD.scid.Rip.B7鼠(n=40)。兩組受鼠都是從轉(zhuǎn)移后12天開始發(fā)病,到轉(zhuǎn)移后15天時(shí),兩組受鼠糖尿病發(fā)病率均為100%(圖18A),經(jīng)x2檢驗(yàn),兩組受鼠糖尿病發(fā)病率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 5.從4周齡的NOD.Ragnull.AI4 TCR轉(zhuǎn)基因鼠分離脾細(xì)胞作為活化的CD8 T細(xì)胞,將相當(dāng)于7×105個(gè)CD
5、8+T細(xì)胞的脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移至NOD.scid(n=35)或NOD.scid.Rip.B7(n=40)鼠(表3)。雖然兩組受鼠均發(fā)生糖尿病,但發(fā)病速度明顯不同,轉(zhuǎn)移后24天,當(dāng)NOD.sicd.Rip.B7組受鼠全部發(fā)生糖尿病時(shí)(發(fā)病率100%),NOD.Scid對照組糖尿病發(fā)病率只有14.3%,經(jīng)x2檢驗(yàn),兩組發(fā)病率有顯著性差異(P<0.001)。轉(zhuǎn)移相當(dāng)于7×104個(gè)CD8+T細(xì)胞的脾細(xì)胞時(shí),轉(zhuǎn)移后45天,NOD.scid.Rip.B7組
6、受鼠全部(n=40)發(fā)生糖尿病時(shí)(表4),NOD.scid對照組(n=35)糖尿病發(fā)病率只有17.1%,經(jīng)x2檢驗(yàn),兩組發(fā)病率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。 6.將9~10天齡NOD.Ragnull.AI4 TCR轉(zhuǎn)基因鼠的靜止的AI4 CD8+T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到NOD.scid.β2mnull.Rip.B7鼠和NOD.scid.Rip.B7鼠各40只。NOD.scid.Rip.B7組被迅速誘發(fā)糖尿病(圖21所示),在轉(zhuǎn)移后2
7、3天開始有受鼠發(fā)生糖尿病,轉(zhuǎn)移后35天100%受鼠發(fā)生糖尿病。但作為對照,NOD.scid.β2mnull.Rip.B7組即使在轉(zhuǎn)移后80天也無1例受鼠發(fā)生糖尿病。 7.將CFSE標(biāo)記的對流感病毒血球凝集素(HA)特異性的CL4 CD8+T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到12只選擇性地在β細(xì)胞上表達(dá)HA基因的NOD.sicd.ins.HA鼠內(nèi),1×107CL4 CD8+T細(xì)胞/受鼠,12只NOD.scid.鼠作為對照。 結(jié)論: 1.在
8、胰島炎啟動前,新生的和幼年的NOD.scid鼠就已經(jīng)表達(dá)與疾病有關(guān)的β細(xì)胞自身抗原。 2.β細(xì)胞上表達(dá)共刺激分子CD80對BDC2.5 CD4+T細(xì)胞的致糖尿病能力無影響。 3.CD8+T細(xì)胞與β細(xì)胞是直接作用的,而NOD.scid受鼠胰島炎的低發(fā)生率提示共刺激分子CD80在胰島淋巴細(xì)胞浸潤過程中對靜止的CD8+T細(xì)胞發(fā)揮了協(xié)同刺激作用。 4.未被免疫的靜止CD8+T細(xì)胞是直接進(jìn)入胰島,在胰島內(nèi)與內(nèi)源性自身抗原相
9、遇并啟動胰島炎,隨后CD8+T細(xì)胞在胰島內(nèi)增殖和擴(kuò)增。 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)1.關(guān)于CD8+ T細(xì)胞在1型糖尿病中的作用及其作用方式的研究,國內(nèi)至今尚未見有報(bào)道;國外雖然有這方面的研究,但尚無定論。本研究利用過繼轉(zhuǎn)移的方法,研究發(fā)現(xiàn)CD8 T細(xì)胞通過與胰島β細(xì)胞直接作用,啟動了糖尿病的發(fā)生,目前國內(nèi)外未見報(bào)道。 2.利用過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在糖尿病發(fā)病過程中,共刺激分子對靜止CD8 T細(xì)胞的活化依賴于β細(xì)胞上表達(dá)MHC I類分子
10、。對此國內(nèi)尚未見報(bào)道。 3.通過CFSE標(biāo)記靜止的CD8 T細(xì)胞,首次發(fā)現(xiàn)CD8 T細(xì)胞是直接進(jìn)入胰島,在胰島內(nèi)被活化,而不是在胰腺淋巴結(jié)等胰腺外的淋巴器官被活化。 本研究采用間接免疫熒光技術(shù),檢測了26例SIH患者血清中的抗甲狀旁腺自身抗體,從體液免疫方面探討SIH的自身免疫性。運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù),分析了10例SIH患者外周血淋巴細(xì)胞亞群及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá),從細(xì)胞免疫方面探討SIH的自身免疫性。 方法:
11、 1、研究對象:散發(fā)性特發(fā)甲旁減患者26例及其直系親屬112例和健康對照60例。 2、抗甲狀旁腺抗體的檢測:采用間接免疫熒光技術(shù),選用猴子甲狀旁腺作底物抗原,用DAPI染核定位甲狀旁腺細(xì)胞。結(jié)果先在熒光顯微鏡下觀察,抗體滴度1:10陽性者,再按1:100稀釋重復(fù)上述步驟。然后用共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)進(jìn)行掃描并采集圖像。488nm波長的光激發(fā)綠色熒光圖像(FITC標(biāo)記的抗體)、356nm波長的光(紫外光,UV)激發(fā)藍(lán)色熒
12、光圖像(DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核)。 3、血清鈣、血清磷和血清鎂含量檢測:分別用偶氮砷III法、紫外直接沉淀法和二甲苯胺藍(lán)比色法。 4、血清FT3、FT4、TSH、Cortisol、TPOAb檢測:采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法,iPTH用雙抗體夾心法。 5、外周血淋巴細(xì)胞亞群的分析:從ACD抗凝的新鮮外周血分離單個(gè)核細(xì)胞,用熒光標(biāo)記的抗體染色,洗滌去除未結(jié)合的抗體后,應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。 6、流式細(xì)胞分析:用
13、Becton Dickinson FACScalibur流式細(xì)胞儀檢測,激發(fā)光為氬離子激光488nm譜線,使用熒光校準(zhǔn)微球校準(zhǔn)儀器,調(diào)整各熒光補(bǔ)償。首先檢測對照管,建立二維散點(diǎn)圖,在散點(diǎn)圖上調(diào)整參數(shù)前向散射光(FSC)及側(cè)向散射光(SSC),調(diào)整閾值,圈定淋巴細(xì)胞射門以獲取細(xì)胞。 結(jié)果: 1、一般指標(biāo)治療前26例患者血清鈣與iPTH水平均明顯降低,與直系親屬組及正常對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均小于0.01),血清磷水
14、平明顯升高,與直系親屬組及正常對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均小于0.05),以上各指標(biāo)在直系親屬組與正常對照組之間無顯著性差異(P均大于0.05)。3組血清鎂比較雖然無顯著性差異,但其中4例SIH患者血清鎂略低于正常范圍;3組FT3,F(xiàn)T4,TSH,Cortisol及TPOAb等均在正常范圍,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異(P均大于0.05)。 2、抗甲狀旁腺抗體 26例SIH患者中有10例(8例為女性)患者的血清1:10稀釋時(shí)抗甲
15、狀旁腺抗體陽性,陽性率38.46%,其中3例在1:100稀釋時(shí)仍呈陽性反應(yīng)。112例患者直系親屬中有11例血清1:10稀釋時(shí)抗甲狀旁腺抗體陽性,陽性率9.82%,60例正常對照組中有4例血清1:10稀釋時(shí)抗甲狀旁腺抗體呈陽性反應(yīng),陽性率6.67%,SIH患者組陽性率明顯高于直系親屬組與正常對照組(P均小于0.01),直系親屬組與正常對照組抗體陽性率無顯著性差異(P>0.05)??贵w陽性的患者與抗體陰性的患者血清鈣、磷、鎂水平無顯著性差異
16、(P均大于0.05)。兩組性別、年齡構(gòu)成無顯著性差異,病程及血清iPTH水平比較差異雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但抗體陰性的患者病程較抗體陽性的患者有延長的趨勢,并且其血清iPTH水平較陽性組患者有降低的趨勢。 3、淋巴細(xì)胞表型的檢測所測的淋巴細(xì)胞亞群中,CD4+,CD8+,CD4+比CD8+比值,CD5+,CD19+,CD5+CD19+等在三組研究對象間結(jié)果相似,三組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SIH患者外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)
17、胞的百分率較健康對照組及患者直系親屬組低,二者比較有顯著性差異(P<0.01),患者直系親屬組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的百分率與健康對照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論: 散發(fā)性特發(fā)甲旁減患者體內(nèi)自身反應(yīng)性抗體的存在以及CD4+CD25+Treg細(xì)胞的改變,表明其自身免疫功能的紊亂。 本研究的創(chuàng)新點(diǎn): 1、首次對散發(fā)性特發(fā)甲旁減患者外周血中CD4+CD25+Treg細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行了研
18、究,從細(xì)胞免疫學(xué)角度探討疾病的自身免疫發(fā)病機(jī)制,檢索近20年的文獻(xiàn),國內(nèi)外未見任何報(bào)道。 2、首次利用流式細(xì)胞技術(shù),探討了散發(fā)性特發(fā)甲旁減患者外周血中單個(gè)核細(xì)胞淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá),檢索近20年的文獻(xiàn),國外只有1篇關(guān)于特發(fā)性甲旁減淋巴細(xì)胞亞群的研究報(bào)道。 3、利用間接免疫熒光技術(shù),對散發(fā)性特發(fā)甲旁減患者體內(nèi)抗甲狀旁腺自身抗體的存在進(jìn)行了研究,從體液免疫角度探討疾病的自身免疫發(fā)病機(jī)制,至今國內(nèi)未見任何報(bào)道,國外的研究也很少。
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