小檗堿對(duì)人食管鱗癌細(xì)胞的放射增敏作用及其機(jī)制研究.pdf

1、[研究背景]食管癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤,以其高發(fā)病率和不良預(yù)后嚴(yán)重威脅著人類身體健康。在我國(guó),食管癌的發(fā)病率逐年升高,死亡率僅次于胃癌,不僅危害人類健康也給患者家庭和社會(huì)造成沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。放射治療作為腫瘤治療的三大主要手段之一,可以明顯緩解患者的癥狀,改善患者生命質(zhì)量。但是腫瘤復(fù)發(fā)、放射抗拒和嚴(yán)重的副作用等問(wèn)題極大地限制了放射的治療效果和臨床應(yīng)用。因此降低腫瘤對(duì)放射的耐受,增強(qiáng)腫瘤的放射敏感性,減輕放射的副作用是現(xiàn)在醫(yī)學(xué)亟待解決的問(wèn)題。<

2、br>　　 小檗堿又稱黃連素,是從毛莨科黃連屬植物黃連、黃柏的根莖中提取的異喹啉類生物堿。研究證明,小檗堿具有細(xì)胞毒性,可以通過(guò)抑制蛋白合成,阻滯細(xì)胞周期,促進(jìn)細(xì)胞凋亡等多種途徑對(duì)多種腫瘤細(xì)胞(如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝癌、胃癌、前列腺癌、骨肉瘤等)產(chǎn)生抑制作用。最近研究指出,小檗堿的腫瘤抑制作用也與其抑制IKK的磷酸化和P65的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而抑制NF—kB的組成型激活有關(guān)。除了直接的腫瘤殺傷作用外,也有研究證明小檗堿能夠通過(guò)誘導(dǎo)自噬對(duì)非小細(xì)胞肺

3、癌起到放射增敏作用。另外,小檗堿也可通過(guò)抑制血管生成抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
　　 [研究目的]本課題主要研究小檗堿是否在食管鱗狀細(xì)胞癌放射治療中具有增敏作用,并對(duì)其放射增敏機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 [研究方法]為了完成上述研究目的,主要進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):
　　 一、MTT方法檢測(cè)小檗堿對(duì)人食管癌細(xì)胞和人正常成纖維細(xì)胞的增殖抑制作用
　　 二、利用平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小檗堿對(duì)人食管癌細(xì)胞和人正常成纖維細(xì)胞是否具有放射增敏

4、效果
　　 三、利用免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在小檗堿和／或X-ray處理細(xì)胞后γ-H2AX及RAD51焦點(diǎn)的形成與持續(xù)情況
　　 四、利用Western Blotting及Real—time PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小檗堿和／或X—ray處理前后細(xì)胞內(nèi)RAD51、Ku70、Ku86的表達(dá)量有無(wú)差異
　　 五、利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小檗堿處理食管癌細(xì)胞后細(xì)胞周期的變化
　　 六、利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)小檗堿處理食管癌細(xì)胞后

5、對(duì)RAD51啟動(dòng)子的調(diào)控作用
　　 七、RNA干擾實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RAD51缺失后對(duì)食管癌細(xì)胞是否起到放射增敏作用
　　 八、免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在食管癌組織及癌旁正常組織中RAD51的表達(dá)情況
　　 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　 一、小檗堿對(duì)食管鱗癌細(xì)胞KYSE30、KYSE450及人正常成纖維細(xì)胞(HNF)具有明顯的抑制作用并呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。
　　 二、低濃度小檗堿對(duì)食管鱗癌細(xì)胞KYSE30和KYSE45

6、0具有明顯的放射增敏作用,而對(duì)人正常成纖維細(xì)胞無(wú)放射增敏作用。
　　 三、小檗堿預(yù)處理食管鱗癌細(xì)胞KYSE30和KYSE450,可以顯著抑制DNA雙鏈斷裂(DSBs)的修復(fù),而不影響人類正常成纖維細(xì)胞對(duì)DSBs的修復(fù)。
　　 四、小檗堿對(duì)非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)通路的關(guān)鍵蛋白Ku70、Ku86無(wú)下調(diào)作用,對(duì)同源重組(HR)修復(fù)通路的關(guān)鍵蛋白R(shí)AD51有明顯下調(diào)作用。
　　 五、小檗堿對(duì)RAD51的下調(diào)與細(xì)胞

7、周期的改變無(wú)關(guān)。
　　 六、小檗堿能夠下調(diào)電離輻射引起的RAD51的上調(diào)。
　　 七、小檗堿能夠作用于RAD51的啟動(dòng)子,抑制RAD51的轉(zhuǎn)錄活性,從而對(duì)食管鱗癌細(xì)胞KYSE30和KYSE450起到放射增敏作用。
　　 八、RAD51缺失后可以對(duì)食管鱗癌細(xì)胞KYSE30和KYSE450起到放射增敏作用。
　　 九、RAD51在食管鱗癌組織中普遍高表達(dá)。
　　 [結(jié)論]低濃度小檗堿可以通過(guò)顯著下調(diào)D