頸椎后縱韌帶骨化癥發(fā)病機制的比較蛋白質組學研究.pdf

1、目的: 頸椎后縱韌帶骨化癥(ossification of posterior longitudinal ligament,OPLL)是臨床上常見的脊柱疾患,發(fā)病率可高達20％～34％。OPLL的致癱幾率顯著高于其他頸椎退變性疾病,其原因包括缺乏有效的早期篩選和診斷方法、自然史不明無法確定手術時機、術后骨化物持續(xù)生長等。近年來對其發(fā)病機制的研究取得了一些成果,如COL6A1限制性片段多態(tài)性與OPLL相關、應力因素是骨化灶進展的重

2、要局部因素等,但其發(fā)病機制仍不明確。本研究采用差異蛋白質組學方法,以熒光差異凝膠電泳(differential gel electrophoresis,DIGE)及質譜技術篩選并鑒定OPLL患者頸椎后縱韌帶組織中差異表達蛋白質,以期尋找OPLL發(fā)生、發(fā)展過程中特異的蛋白標記物,為臨床OPLL篩查和診斷、預后判斷、尋找治療藥物靶點、了解OPLL發(fā)生發(fā)展的分子機制提供研究基礎。 方法: 以頸椎前路椎體次全切除術中獲得的OPL

3、L后縱韌帶組織和外傷患者正常后縱韌帶組織做為研究對象。液氮研磨、超聲破碎抽提組織全息蛋白質樣本,普通雙向凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)分離,銀染顯色鑒定蛋白質樣本質量。以Cy3、Cy5及Cy2熒光素標記的OPLL頸椎后縱韌帶組織及健康外傷患者韌帶組織的蛋白質標本各50 ug進行2-DE,以所有樣本等量混合物50 ug做為內參,獲得其熒光差異表達圖譜,DeCyder 6.5圖譜分析軟件

4、(GE healthcare公司)進行膠內、生物學差異分析,確定表達存在差異的蛋白質點。加大上樣量同法獲得普通2-DE制備膠,手工切膠后酶解獲得肽段樣本。采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrum,MALDI-TOF MS)或液相色譜串聯(lián)質譜技術(Liquid chromatography-Mass

5、 spectrum,LC/MS)進行鑒定并分析差異表達的蛋白質點。文獻回顧總結各差異蛋白的基本信息、分子功能、細胞分布及其參與的生命過程,推測其在OPLL發(fā)病機制中的可能作用。對有深入研究價值的差異表達蛋白質采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-TimeQuantitive Polymerase Chain Reaction RT-PCR)技術從mRNA水平進一步驗證DIGE及質譜結果準確性。 結果:超聲破碎后行普通2-DE

6、獲得10張2-DE圖譜,圖譜重復性好,蛋白質抽提、分離情況及電泳條件滿意。行熒光差異雙向凝膠電泳獲得4張熒光膠圖及12張模擬膠圖,每張膠圖上共約1100個蛋白質點。膠間比較(Biological VariationAnalysis,BVA)共篩選出50個差異表達蛋白質點,其中8個蛋白質點在OPLL韌帶組織中上調,42個蛋白質點下調；最大上調比例為2.74倍；最大下調比例為7.42倍。手工切膠獲得45個蛋白質點的肽段樣本,分別采用MALD

7、I-TOF MS、MALDI-TOF-TOF MS和高效液相色譜聯(lián)用質譜,鑒定為28個蛋白質或肽段。文獻回顧后根據(jù)蛋白質功能的不同,將其分為7類：轉運和結合蛋白、代謝酶類、血纖維蛋白、免疫球蛋白、細胞結構蛋白、信號蛋白和未知功能蛋白。其中Vial的編碼基因COL6A1在近年對孿生子和OPLL家系的研究中已確定為OPLL發(fā)病的重要危險因素,本研究首次確認其在蛋白水平存在差異表達；與膠原蛋白代謝相關的酶PRELP在OPLL韌帶組織中表達亦有

8、減少,該酶的功能目前尚不完全明確；OGN與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogeneic protein,BMP)存在協(xié)同關系,后者目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的最重要的誘導成骨因子；N-RAP具有應力傳導的作用,而應力已被證實是OPLL病情進展的重要局部因素,N-RAP有可能在力學信號轉化為生物信號的過程中發(fā)揮一定作用。RT-PCR驗證實驗發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶(carbonic anhydrase I,CA1)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的激素脫氫酶(NA

9、D(P) dependent steroid dehydrogenase-like,NDSHL),骨生成誘導因子(osteoglycin OG,OGN),VI型膠原α鏈(alpha-1 collagenVI,VIα1)在OPLL韌帶組織中mRNA拷貝數(shù)低于正常韌帶組織,但CA1、OGN的結果差異無統(tǒng)計學意義。膽綠素還原酶B(biliverdin reductase B,BVRB),伴肌動蛋白相關錨定蛋白(nebulin-related

10、anchoring protein,N-RAP)在OPLL韌帶組織中mRNA拷貝數(shù)高于正常韌帶組織,但BVRB的結果差異無統(tǒng)計學意義。另外,本研究發(fā)現(xiàn)一個假設蛋白和一個未命名蛋白在胃癌組織中表達上調,它們可能與OPLL的發(fā)生、發(fā)展有關。 結論: 本研究探索了后縱韌帶組織全蛋白質的抽提方法,成功制備了OPLL韌帶組織和正常后縱韌帶組織的雙向凝膠,初步建立了頸椎后縱韌帶組織的2-DE參考凝膠圖譜。應用DIGE技術探索了OPL

11、L的發(fā)病機制,建立了定量比較蛋白質組學的技術路線。以往OPLL發(fā)病機制研究停留在分子遺傳學領域或針對個別蛋白質的局限性,本研究首次把定量比較蛋白質組學應用于OPLL發(fā)病機制的研究,為臨床相關疾病的同類研究進行了技術探索。DIGE實驗篩選出VIa1表達存在差異,與既往研究吻合,在一定程度上驗證了DIGE實驗的準確性。在DIGE篩選出的差異表達蛋白質中可能存在與OPLL發(fā)生、發(fā)展相關的重要蛋白,為進一步深入研究OPLL發(fā)病機制提供了研究基礎

12、。初步的鑒定研究提示,膠原蛋白的表達和代謝異常在OPLL的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用。RT-PCR實驗中,OGN、BVRB實驗結果與DIGE和質譜實驗結果不符合,考慮有可能是樣本量、實驗誤差或RNA-蛋白之間的不一致性導致。下一步,我們將對質譜鑒定的差異蛋白進行免疫組化、ELISA等實驗以及RNA干擾,進一步驗證其表達變化,深入研究這些蛋白在OPLL的發(fā)生、發(fā)展過程中可能的作用,為發(fā)現(xiàn)診斷及預后判斷的蛋白標志物,尋找治療藥物靶點,了解OP