Notch信號(hào)通路在常染色體顯性多囊腎病發(fā)生中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 常染色體顯性多囊腎?。ˋDPKD）是人類最常見的單基因遺傳性腎病，發(fā)病率約為 1/400-1/1000，我國(guó)約有150萬(wàn)患者，占終末期腎衰病因的第三位（5—10％），其主要病理特征為腎臟出現(xiàn)眾多進(jìn)行性增大的液性囊泡，最終破壞腎臟的結(jié)構(gòu)和損害腎功能；50％患者在60歲時(shí)進(jìn)展至終末期腎衰。ADPKD 除累及腎臟外，還可引起肝、胰囊腫、心瓣膜病、結(jié)腸憩室和顱內(nèi)動(dòng)脈瘤等腎外病變。該病家系代代發(fā)病，子代發(fā)病機(jī)率為5

2、0％，是一類嚴(yán)重危害人類健康的系統(tǒng)性疾病。
　　 ADPKD 囊腫形成及進(jìn)展的病理生理過程主要有：細(xì)胞增殖和凋亡異常，細(xì)胞極性改變和分化不良，細(xì)胞外基質(zhì)重塑、間質(zhì)纖維化及液體分泌增加。雖則，ADPKD的致病基因已經(jīng)明確主要為pkd1和pkd2，但其發(fā)病機(jī)制仍然不是十分清楚，目前研究已經(jīng)證明其涉及細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路的異常，如：cAMP—PKA(cAMP：cyclicadenosine monophosphate，環(huán)磷酸腺苷；PKA

3、：protein kinase A，蛋白激酶A)信號(hào)通路、生長(zhǎng)因子相關(guān)信號(hào)通路、Wnt(wingless-type MMTV integration site family)信號(hào)通路、哺乳類動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR) 相關(guān)信號(hào)通路等，其單一或協(xié)同作用引起囊泡襯里上皮細(xì)胞異常增殖和囊液過度分泌而導(dǎo)致囊泡的產(chǎn)生和發(fā)展。
　　 Notch信號(hào)通路是一條保守的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，

4、廣泛存在于從無(wú)脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物等多個(gè)物種。Notch信號(hào)通路由受體、配體和DNA 結(jié)合蛋白3 部分構(gòu)成。相鄰細(xì)胞上的受體和配體結(jié)合后導(dǎo)致受體構(gòu)象改變暴露出蛋白水解酶的酶切位點(diǎn)，并經(jīng)隨后2次蛋白水解作用釋放出具有核定位信號(hào)的胞內(nèi)段(Notch intracellular domain，NICD)，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)；激活其下游靶基因，參與調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖和凋亡。Notch信號(hào)通路的活化過程中，受體變構(gòu)后的蛋白水解作用至關(guān)重要；在γ-分

5、泌酶(γ-Secretase)的作用下直接釋放出具有活性的NICD。實(shí)驗(yàn)證實(shí)γ-分泌酶抑制劑可特異性的抑制γ-分泌酶的活性，減少NICD的釋放，從而抑制Notch通路的活化。目前在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路4種同源受體，即Notch l～4和5種同源配體：
　　 Delta-l、Delta-3、Delta-4、Jagged-1、Jagged-2 以及兩類下游靶基因：Hes和Hey家族。研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路與腎、神經(jīng)

6、干細(xì)胞、肺、胰腺、軟骨以及前列腺等組織和器官的分化發(fā)育密切相關(guān)。
　　 作為一種類腫瘤性疾病，ADPKD 腎組織中是否存在Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，Notch信號(hào)通路是否也在多囊腎病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用？尚未見相關(guān)報(bào)道。
　　 因此，本課題旨在闡明Notch信號(hào)通路在ADPKD 發(fā)生中的作用，并探討抑制Notch信號(hào)對(duì)ADPKD 囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖的影響及其具體機(jī)制；研究Notch信號(hào)通路與ADPKD 進(jìn)展中

7、發(fā)揮重要作用的mTOR信號(hào)通路之間的相互調(diào)控關(guān)系，為常染色體顯性多囊腎病的治療提供新的藥物作用靶點(diǎn)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、采用reAltime PCR 方法觀察ADPKD患者和正常對(duì)照腎組織中Notch信號(hào)通路受體Notch 1～4、配體Jagged1和下游靶基因hes1mRNA水平的表達(dá)差異；
　　 2、采用Western blotting 方法分析ADPKD患者和正常對(duì)照腎組織中Notch信號(hào)通路受體

8、Notch1，配體Jagged1和下游靶基因Hes1蛋白水平的表達(dá)差異；
　　 3、采用免疫組織化學(xué)方法觀察ADPKD患者和正常對(duì)照腎組織中Notch信號(hào)通路受體Notch1，配體Jagged1和下游靶基因Hes1的表達(dá)及細(xì)胞定位差異；
　　 4、采用MTT 方法，以腎小管上皮細(xì)胞RCTEC為對(duì)照，檢測(cè)不同濃度（0、1、2、5、10nmol/L）的DBZ（γ-分泌酶抑制劑——特異性Notch 抑制劑）對(duì)ADPKD 囊腫襯

9、里上皮細(xì)胞WT9-12的增殖抑制作用；
　　 5、采用RNAi 方法特異性抑制Notch1信號(hào)，觀察對(duì)ADPKD 囊腫襯里上皮細(xì)胞WT9-12周期的影響，并用Western blotting 方法驗(yàn)證結(jié)果。
　　 6、不同濃度（0、5、10nmol/L）的DBZ（γ-分泌酶抑制劑——特異性Notch信號(hào)抑制劑）干預(yù)ADPKD 囊腫襯里上皮細(xì)胞WT9-12，用Western blotting 方法檢測(cè)Notch1、Hes1

10、的表達(dá)以驗(yàn)證Notch信號(hào)通路的下調(diào)；
　　 7、用Western blotting 方法檢測(cè)DBZ下調(diào)Notch信號(hào)后mTOR通路重要信號(hào)分子mTOR及其活性形式p-mTOR的表達(dá)情況；
　　 8、用Western blotting 方法檢測(cè)DBZ下調(diào)Notch信號(hào)后mTOR下游信號(hào)分子4E-Bp1及其活性形式p-4E-Bp1的表達(dá)情況；
　　 9、用Western blotting 方法檢測(cè)DBZ下調(diào)Notc

11、h信號(hào)后mTOR下游信號(hào)分子pS706K及其活性形式p-pS706K的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在人的正常腎組織中，Notch1、Jagged1主要分布在腎小管上皮細(xì)胞胞漿，表達(dá)較弱；在ADPKD 腎囊腫組織中主要表達(dá)于胞漿及胞核中，且呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。
　　 2、采用reAltime PCR 方法檢測(cè)到人ADPKD 腎組織中Notch信號(hào)通路分子受體Notch1、Notch2

12、、Notch3、Notch4、配體Jagged1和下游靶基因hes1mRNA的表達(dá)水平明顯高于正常腎組織。
　　 3、采用Western blotting 方法檢測(cè)到人ADPKD 腎組織中受體Notch1、配體Jagged1和下游靶基因Hes1的蛋白表達(dá)明顯高于相應(yīng)正常腎組織。
　　 4、采用MTT 法檢測(cè)γ分泌酶抑制劑DBZ對(duì)WT9-12細(xì)胞的增殖抑制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10nmol/L DBZ作用24小時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率達(dá)6

13、0％以上，而對(duì)正常腎小管細(xì)胞RCTEC 無(wú)明顯增殖抑制作用。這種增殖抑制作用對(duì)濃度的升高而增大，但無(wú)明顯的時(shí)間依賴性，說(shuō)明下調(diào)Notch通路抑制囊腫襯里上皮細(xì)胞的增殖作用是迅速有效的。
　　 5、采用RNAi的方法特異性干擾囊腫襯里上皮細(xì)胞WT9-12中的Notch1，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)其將細(xì)胞周期阻滯在S 期，Western blotting 方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)P21下調(diào)而負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白Cyclin A上調(diào)，與流式

14、細(xì)胞術(shù)的結(jié)果一致。
　　 6.、采用Western blotting 方法發(fā)現(xiàn)Notch通路抑制劑DBZ在下調(diào)Notch1/Hes1通路的同時(shí)也下調(diào)了mTOR信號(hào)通路中mTOR、p-mTOR、p-4E-Bp1、p-p70S6K的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 本研究從mRNA、蛋白表達(dá)水平以及組織細(xì)胞定位等多個(gè)層面證實(shí)常染色體顯性多囊腎病腎組織中Notch信號(hào)通路被異常激活，并可能為囊腫發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。通過體