Hippo通路在常染色體顯性多囊腎病發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、研究背景和目的
　　 常染色體顯性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是一種常見的遺傳性腎臟疾病，以雙。腎出現(xiàn)多發(fā)性進(jìn)展性的液性囊泡為特點(diǎn)，除引起腎衰竭外，還累及多種腎外器官，如肝囊腫、胰膽管擴(kuò)張、結(jié)腸憩室、腦動(dòng)脈瘤、心臟瓣膜畸形等表現(xiàn)，是一種系統(tǒng)性疾病，嚴(yán)重危害人類健康。進(jìn)入終末期。腎衰竭的患者需要依靠透析或腎移植維持生命，給社會(huì)和家庭帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)。目

2、前已知ADPKD致病基因主要為pkd1和pkd2，但該病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前主要有“二次打擊”和“纖毛致病”兩種理論學(xué)說(shuō)。囊腫襯里上皮細(xì)胞過度增殖是其發(fā)病機(jī)制之一，因此，ADPKD也被稱為類腫瘤疾病。現(xiàn)有研究已證明，ADPKD腎臟囊腫發(fā)生及進(jìn)展的病理生理過程主要是：腎囊腫襯里上皮細(xì)胞類腫瘤樣持續(xù)增殖與凋亡異常；細(xì)胞極性改變和分化不良及囊腔液體在囊腫內(nèi)大量聚集積聚，擠壓周圍腎實(shí)質(zhì)。上述過程使得正常腎組織不斷產(chǎn)生新的囊腫，現(xiàn)有囊腫也

3、逐漸增大，壓迫正常腎組織，最終發(fā)展為終末期腎病。
　　 作為一種類腫瘤性疾病，ADPKD與調(diào)控器官大小的信號(hào)通路改變密切相關(guān)。mTOR信號(hào)通路是與細(xì)胞異常增殖、腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的通路之一。近年來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了除mTOR通路之外的另一條專一參與器官大小調(diào)控的信號(hào)通路，即Hippo通路，后者主要通過綜合調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡發(fā)揮控制器官大小的作用。正是由于Hippo通路的重要功能，使得其在人類腫瘤及其他疾病的發(fā)病機(jī)制中扮演了重要的角色。

4、
　　 Hippo蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，Hippo信號(hào)通路于2007年采用遺傳鑲嵌掃描技術(shù)在果蠅中發(fā)現(xiàn)Hippo激酶后命名。Hippo通路在哺乳動(dòng)物中高度保守，目前有很多研究證明，該通路主要信號(hào)分子對(duì)器官生長(zhǎng)的大小具有重要的調(diào)控作用。現(xiàn)有證據(jù)表明，Hippo通路對(duì)腫瘤發(fā)生具有重要影響。人腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN和人黑色素瘤組織中分別觀察到SAV1和Mob1基因的突變，結(jié)腸癌組織中Mob1表達(dá)較正常結(jié)腸組織明顯下調(diào)。Lats1/

5、2的下調(diào)現(xiàn)象存在于多種腫瘤(如人類卵巢癌、侵襲性乳腺癌、星形細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和急性淋巴細(xì)胞白血病等)中；人類軟組織肉瘤和結(jié)腸癌中也觀察到Mst1/2表達(dá)的降低；在肝臟中同時(shí)條件性敲除Mst1和Mst2基因也可引起巨大肝細(xì)胞癌，但在這種小鼠中再次敲除YAP基因則可逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞表型。作為Hippo通路下游的主要效應(yīng)分子，在人類多種腫瘤(如肝癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌和前列腺癌)中也觀察到Y(jié)AP的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位的增加。
　　 作為近

6、年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一條信號(hào)通路，到目前為止，Hippo通路在ADPKD中的研究?jī)H限于該通路靶蛋白YAP在ADPKD動(dòng)物模型Pkd-1基因敲除小鼠囊腫襯里上皮細(xì)胞與擴(kuò)張的腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)變化，但Hippo通路中其他分子的改變及其在人類腎臟與其它動(dòng)物模型中的變化，尚未見報(bào)道。此外，Hippo通路是否與細(xì)胞增殖相關(guān)的其它信號(hào)通路存在聯(lián)系，共同引起上皮細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和凋亡異常也尚無(wú)研究。因此，本研究旨在觀察Hippo通路分子及靶分子YAP與TAZ

7、在ADPKD腎組織中的表達(dá)變化，探討Hippo通路分子對(duì)于腎囊腫襯里上皮細(xì)胞過度增殖的影響及其機(jī)制，為臨床尋找治療多囊腎病的有效藥物奠定實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1.采用免疫熒光化學(xué)染色及激光共聚焦方法，觀察Han：SPRD大鼠雜合型及野生型腎組織中LATS1、YAP及TAZ的表達(dá)及分布變化；
　　 2.采用Western blotting方法檢測(cè)Han：SPRD大鼠雜合型及野生型腎組織中LATS1

8、、磷酸化LATS1、YAP、磷酸化YAP及TAZ蛋白水平表達(dá)差異；
　　 3.采用Real-time PCR方法檢測(cè)ADPKD患者與正常對(duì)照腎組織中MST1/2、LATS1/2、YAP和TAZ mRNA的表達(dá)變化；
　　 4.采用MTT法觀察用RNAi特異性抑制WT9-12細(xì)胞中YAP和TAZ表達(dá)后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力的影響。
　　 5.采用流式細(xì)胞術(shù)與Western blotting法檢測(cè)用RNAi特異性抑制WT

9、9-12細(xì)胞中YAP與TAZ表達(dá)后細(xì)胞凋亡的變化；
　　 6.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)用RNAi特異性抑制WT9-12細(xì)胞中YAP與TAZ表達(dá)后細(xì)胞周期的變化；并用Real-time PCR與Western blotting法在mRNA和蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證細(xì)胞周期改變相關(guān)蛋白的表達(dá)；
　　 7.采用RNAi特異性抑制WT9-12細(xì)胞中LATS1表達(dá)后，用Western blotting法檢測(cè)YAP蛋白及YAP磷酸化水平變化，以驗(yàn)證

10、WT9-12細(xì)胞中，LATS1是否為YAP磷酸化的主要蛋白；
　　 8.采用MTT法發(fā)現(xiàn)用RNAi特異性抑制WT9-12細(xì)胞中LATS1表達(dá)后對(duì)細(xì)胞增殖的影響；
　　 9.采用流式細(xì)胞術(shù)與Western blotting法檢測(cè)用RNAi特異性抑制WT9-12細(xì)胞中LATS1表達(dá)后細(xì)胞凋亡的變化；
　　 10.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)用RNAi特異性抑制WT9-12細(xì)胞中LATS1表達(dá)后細(xì)胞周期的變化；并用Western

11、 blotting法驗(yàn)證細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)變化。
　　 結(jié)果
　　 1.采用免疫熒光化學(xué)染色及激光共聚焦方法發(fā)現(xiàn)Han：SPRD大鼠雜合型腎囊腫襯里上皮細(xì)胞LATS1表達(dá)較野生型明顯減弱，但YAP卻呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，且在胞漿與胞核中均有分布，而野生型僅在于胞漿中微弱表達(dá)，胞核內(nèi)無(wú)YAP分布；TAZ的表達(dá)與分布在雜合型和野生型大鼠無(wú)明顯差異；
　　 2.采用Western blotting方法發(fā)現(xiàn)在Han：SPRD大

12、鼠雜合型腎組織中LATS1和磷酸化LATS1蛋白表達(dá)量較野生型明顯降低；YAP蛋白表達(dá)量則較野生型多，而磷酸化YAP蛋白表達(dá)水平顯著減少；TAZ蛋白表達(dá)二者無(wú)明顯差異；
　　 3.采用Real-time PCR方法發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)ADPKD患者腎組織中MST1/2、LATS1和TAZ的mRNA表達(dá)均較正常對(duì)照腎組織降低，YAP的mRNA表達(dá)二者無(wú)明顯差異；
　　 4.采用MTT法發(fā)現(xiàn)用RNAi特異性抑制WT9-12細(xì)胞中YAP表

13、達(dá)可抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力，48、72和96小時(shí)細(xì)胞增殖的抑制率分別為22.66％、31.41％和33.37％；而下調(diào)TAZ對(duì)WT9-12細(xì)胞僅有輕微的抑制作用；
　　 5.采用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)用RNAi特異性抑制WT9-12細(xì)胞中YAP與TAZ表達(dá)后不增加WT9-12細(xì)胞的凋亡率，Western blotting法也表明促凋亡蛋白caspse-3的底物PARP蛋白無(wú)明顯變化，說(shuō)明下調(diào)YAP與TAZ不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；
　　

14、 6.采用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)用RNAi特異性抑制WT9-12細(xì)胞中YAP表達(dá)48小時(shí)時(shí)能使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，Real-time PCR與Western blotting還發(fā)現(xiàn)G0/G1期特異性周期調(diào)控蛋白CyclinD1與CyclinE的表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有下調(diào)，而周期負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白P21表達(dá)則明顯上調(diào)；但TAZ表達(dá)變化不顯著；
　　 7.采用RNAi特異性抑制WT9-12細(xì)胞中LATS1表達(dá)后，用Western

15、blotting法發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中YAP蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，但YAP磷酸化水平有顯著抑制作用，表明在WT9-12細(xì)胞中，LATS1是磷酸化YAP的主要蛋白，LATS1表達(dá)下調(diào)可增加YAP的活化水平；
　　 8.采用MTT法發(fā)現(xiàn)用RNAi特異性抑制WT9-12細(xì)胞中LATS1表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，24、48、72和96小時(shí)WT9-12細(xì)胞增殖率分別為113.22％、116.27％、111.80％和106.81％：
　　 9.采用流

16、式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)用RNAi特異性抑制WT9-12細(xì)胞中LATS1表達(dá)后對(duì)WT9-12細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響，Western blotting法也表明誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)通路信號(hào)分子caspse-3的底物PARP蛋白裂解無(wú)明顯改變，說(shuō)明下調(diào)LATS1不能抑制細(xì)胞凋亡；
　　 10.采用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)用RNAi特異性下調(diào)WT9-12細(xì)胞中LATS1表達(dá)48小時(shí)能促進(jìn)細(xì)胞周期，使更多細(xì)胞處于S期；Western blotting分析發(fā)現(xiàn)S期特異性周期

17、調(diào)控蛋白CyclinA的表達(dá)明顯上調(diào)，G0/G1期特異性周期調(diào)控蛋白CyclinD1與CyclinE表達(dá)也有所上調(diào)，而負(fù)性調(diào)控蛋白P21的表達(dá)卻明顯下調(diào)，表明LATS1能抑制促進(jìn)WT9-12細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期，導(dǎo)致囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖。
　　 結(jié)論
　　 通過ADPKD患者和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎組織樣本的組織學(xué)觀察、基因表達(dá)的mRNA和蛋白質(zhì)水平都證明腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)Hippo信號(hào)通路被抑制，YAP去磷酸化活